本文關(guān)鍵詞：臍帶間充質(zhì)干細胞衍生的膜微粒促進缺血肢體血管新生的研究　出處：《河北北方學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：動物及臨床研究證實,間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSC)治療缺血性疾病是有效的。目前普遍認為,MSC的治療作用與其旁分泌多種可溶性生物活性分子有關(guān)。真核細胞在凋亡時可釋放膜微粒(Microparticles,MPs),其可作為細胞間生物信號及信息交換的載體,將攜帶的生物活性物質(zhì)和表面受體轉(zhuǎn)移至選定的靶細胞,從而調(diào)整靶細胞的生物學(xué)功能。 本實驗分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSC),并從細胞形態(tài)、分化功能以及表型給予鑒定。然后通過低氧低營養(yǎng)培養(yǎng)誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞凋亡(模擬MSC治療缺血性疾病時發(fā)生的凋亡),從條件培養(yǎng)液中獲取MPs。再以大鼠肢體缺血模型為研究對象,觀察MPs對缺血區(qū)血管新生的影響。最后,通過研究MP對臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)增殖、遷移、管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響,初步探討MPs促血管新生的機制。 分離培養(yǎng)UCMSC,進行成脂、成骨誘導(dǎo)分化；流式檢測CD29、 CD31、CD44、CD45、CD73等表面標(biāo)志表達情況。低氧低營養(yǎng)條件培養(yǎng)誘導(dǎo)其凋亡,流式檢測誘導(dǎo)不同時間(1d、2d、3d、4d)細胞凋亡率,獲取早期凋亡率高,晚期凋亡率低的培養(yǎng)條件,應(yīng)用4℃真空以10000g的轉(zhuǎn)速離心1h條件培養(yǎng)液,收集沉淀,通過流式檢測AnnexinV及細胞表型表達情況,透射電子顯微鏡觀察其形態(tài),BCA法測定蛋白濃度,從而建立制備MPs確切的實驗方法。其次,通過結(jié)扎大鼠右側(cè)股動脈建立肢體缺血模型,以UCMSC、Buffer為對照,在結(jié)扎股動脈第2d將MPs及對照液接種于缺血區(qū),14d后進行激光多普勒灌注成像檢測組織供血情況；并制作肌肉組織石蠟切片,HE染色切片方法評價肌肉組織萎縮情況,CD31免疫組化染色檢測骨骼肌微血管密度；最后,以HUVEC為研究對象,應(yīng)用DiI標(biāo)記UCMSC制備攜帶DiI熒光的MPs與HUVEC共培養(yǎng),檢測不同時間對HUVEC的感染率,來明確MPs與HUVEC的作用方式；為探討MPs促血管新生的機制,實驗以DMEM、10%FBS、10ng·mL-1bFGF為對照,通過流式檢測細胞增殖指數(shù)、Transwell遷移及體外管狀結(jié)構(gòu)形成的測定方法,評價MPs對HUVEC體外增殖、遷移及成管狀能力的影響。 結(jié)果成功分離培養(yǎng)出成纖維狀貼壁細胞,可向成脂成骨分化,并且CD29、CD44、CD73陽性表達,而CD31,CD45表達陰性,符合首屆胎盤來源干細胞國際細胞治療協(xié)會關(guān)于MSC的最低標(biāo)準(zhǔn)；低氧低營養(yǎng)培養(yǎng)UCMSC隨培養(yǎng)時間的延長,早期凋亡逐步增多,但培養(yǎng)至第4d,晚期凋亡明顯增多,為避免晚期凋亡細胞釋放凋亡小體污染MPs,故選擇條件培養(yǎng)3d的培養(yǎng)液制備MPs,通過流式鑒定其大小約為0.15μm,其表面標(biāo)志與親本細胞表達一致,并且Annexin V表達陽性,透射電子顯微鏡觀察其大小約80nm-150nm,符合MPs的基本定義,通過BCA法測出蛋白濃度約為1mg·mL-1。通過結(jié)扎右側(cè)大鼠股動脈后,LDPI檢測右側(cè)血流灌注比左側(cè)降低了56.92%,在缺血區(qū)分別接種Buffer、MSC、MPs14d后,右側(cè)缺血肢體血流恢復(fù)MPs組明顯優(yōu)于Buffer及MSC組；取病理標(biāo)本HE染色發(fā)現(xiàn),Buffer組肌細胞明顯萎縮,并可見大量炎性細胞浸潤,MPs及MSC組肌細胞同正常組一樣排列緊密,未見明顯炎性細胞浸潤；通過CD31免疫組化染色檢測缺血區(qū)肌肉微血管的密度,MPs組明顯高于Buffer、正常組(P0.01),略高于MSC組。流式檢測DiI對UCMSC感染率在99%左右,制備攜帶Dil的MPs與HUVEC共培養(yǎng),作用4h及8h對HUVEC的感染率分別為46.64%及86.55%左右；MPs組對HUVEC的促增殖作用明顯優(yōu)于其他各組(P0.01)；對HUVEC的遷移及成管狀結(jié)構(gòu)能力明顯優(yōu)于DMEM及FBS組(P0.01),略高于bFGF組,但無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果表明從人臍帶中可獲取符合MSC標(biāo)準(zhǔn)的UCMSC,并可通過低氧低營養(yǎng)誘導(dǎo)其凋亡,可獲取符合MPs定義的MSC-MPs,該方法制備的MPs與MSC移植一樣,具有促進缺血肢體血管新生及組織修復(fù)的能力,并通過MSC-MPs促進HUVEC的增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成提供了有利的證據(jù)。以期為MSC探索一種新的治療機制,即由以往旁分泌機制轉(zhuǎn)入一種非細胞、帶膜微粒的機制。
[Abstract]:Animal and clinical studies have shown that mesenchymal stem cells ( MSCs ) are effective in the treatment of ischemic diseases . It is generally believed that the therapeutic action of MSC is related to the secretion of various soluble bioactive molecules . When eukaryotic cells are apoptotic , membrane particles ( MPs ) can be released , which can be used as carriers of inter - cell biological signal and information exchange to transfer the bioactive substances and surface receptors carried to the selected target cells , thereby modulating the biological function of the target cells . Human umbilical cord mesenchymal stem cells ( UCMSC ) were isolated from cultured human umbilical cord mesenchymal stem cells ( UCMSC ) and identified from cell morphology , differentiation function and phenotype . The effects of MPs and control fluids on proliferation , migration and tubular ability of HUVEC were determined by means of flow cytometry . The effects of MPs on proliferation , migration and tubular ability of HUVEC were evaluated by means of flow cytometry . Results The expression of CD29 , CD44 and CD73 was significantly higher than that of the other groups ( P0.01 ) . The results showed that UCMSC conforming to MSC standard can be obtained from human umbilical cord , and it can induce apoptosis by low oxygen and low nutrition . It can obtain MSC - MPs which accord with the definition of MPs . These methods have the ability to promote the angiogenesis and tissue repair of ischemic limbs , and to promote the proliferation , migration and tubular structure formation of HUVEC by MSC - MPs .

【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2

【共引文獻】

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本文編號：1360124