本文關(guān)鍵詞：一種高效hFIX表達(dá)載體的構(gòu)建及其體內(nèi)外的初步實驗研究　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：以B型血友病為研究對象,構(gòu)建含有肝臟特異性調(diào)控元件的載體表達(dá)hFIX基因,利用我們在先前的探索性研究中發(fā)現(xiàn)的具有單一位點(diǎn)整合功能的Rep-RBE核心元件建立的位點(diǎn)特異性整合轉(zhuǎn)基因體系,檢測評估攜有hFIX的載體在模型動物體內(nèi)的動力學(xué)特征,揭示攜有hFIX目的基因的質(zhì)粒的分布、轉(zhuǎn)錄、翻譯、毒性等一系列的動力學(xué)過程和在主要分布器官中的位點(diǎn)特異性整合情況,并根據(jù)實驗結(jié)果在安全性和有效性方面對該系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化和改造。 方法：1、構(gòu)建pRBE HCR hAAT hFIX+pRC、pRBE hAAT hFIX+pRC,細(xì)胞水平表達(dá)hFIX,并與之前構(gòu)建的pRBE CMV hFIX+pRC進(jìn)行比較表達(dá)水平的差異。2、在不同種類細(xì)胞中(HEK293細(xì)胞、A549細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、L02細(xì)胞)表達(dá)構(gòu)建質(zhì)粒,測定hFIX在肝臟特異性調(diào)控元件調(diào)控下表達(dá)差異情況。3、以高壓尾靜脈的方式注射構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)入小鼠體內(nèi),ELISA檢測hFIX在體內(nèi)的表達(dá),PCR檢測質(zhì)粒在體內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)錄。4、檢測系統(tǒng)安全性,跟蹤測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化及肝臟損傷情況。 結(jié)果：1、構(gòu)建的pRBE HCR hAAT hFIX+pRC、pRBE hAAT hFIX+pRC在細(xì)胞中成功表達(dá),體外實驗水平顯示hFIX的表達(dá)量并無顯著性差異。2、通過高壓尾靜脈注射攜帶hFIX表達(dá)基因的質(zhì)粒的小鼠體內(nèi)血漿hFIX水平第一天達(dá)到高峰,pRBE HCR hAAT hFIX+pRC組平均濃度達(dá)到1534.5±342.8ng/ml,pRBE hAAT hFIX+pRC組27.1±10.2ng/ml,pRBE CMV hFIX+pRC組1338.8±241.0ng/ml,注射后hFIX的量隨時間推移而降低,注射后十天pRBE hAAT hFIX基本檢測不到表達(dá),pRBE HCR hAAT FIX+pRC和pRBE CMV hFIX+pRC組表達(dá)平均水平仍然比較高,且pRBE HCR hAAT FIX+pRC高于pRBE CMV hFIX+pRC組。3、PCR和RT-PCR的結(jié)果顯示,外源性的DNA在注射后的第一天能夠分布到所有實驗動物的檢查器官(心、肝、脾、肺、腎)并在其中轉(zhuǎn)錄。4、尾靜脈內(nèi)快速質(zhì)粒注射導(dǎo)致的短時間的急性肝損也通過肝臟轉(zhuǎn)氨酶的檢測水平和肝臟的組織形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)出來,這種變化在10天內(nèi)快速恢復(fù)正常。由此證明,該系統(tǒng)可以安全、有效的介導(dǎo)外源基因在動物體內(nèi)的長期表達(dá)。
[Abstract]:Objective: to construct a vector containing liver specific regulatory elements for expression of hFIX gene in type B hemophilia. The site-specific integration transgenic system was established using Rep-RBE core elements with single locus integration found in previous exploratory studies. The kinetic characteristics of the vector carrying hFIX in model animals were evaluated to reveal the distribution, transcription and translation of the plasmid carrying the hFIX target gene. A series of kinetic processes such as toxicity and site-specific integration in the main distributed organs were carried out, and the system was further optimized and modified according to the experimental results in terms of safety and effectiveness. Methods to construct pRBE HCR hAAT hFIX pRBE hAAT hFIX pRC-1, and express hFIX at cell level. The expression level of pRBE CMV hFIX pRC was compared with that of pRBE CMV hFIX pRC. HepG2 cell line (L02 cell) was used to construct the plasmid, and the difference of hFIX expression under the regulation of liver specific regulatory element was measured. 3. The expression of hFIX in mice was detected by Elisa. The distribution of plasmid in vivo, transcription of .4and the safety of the system were detected by Elisa. The changes of alanine aminotransferase activity and liver injury were measured. Results the constructed pRBE HCR hAAT hFIX pRBE hAAT hFIX pRC was successfully expressed in the cells. The experimental level in vitro showed that there was no significant difference in the expression of hFIX. The plasma hFIX level reached a peak on the first day after injection of plasmid carrying hFIX expression gene through high-pressure tail vein in mice. The average concentration of pRBE HCR hAAT hFIX pRC was 1534.5 鹵342.8 ng / ml. PRBE hAAT hFIX pRC group (27.1 鹵10.2ng / ml), CMV hFIX pRC group (1338.8 鹵241.0ng / ml). The amount of hFIX decreased with time after injection, and the expression of pRBE hAAT hFIX was not detected 10 days after injection. The average expression levels of pRBE HCR hAAT FIX pRC and pRBE CMV hFIX pRC were still high. The results of pRBE HCR hAAT FIX pRC were higher than those of pRBE CMV hFIX pRC group. Exogenous DNA can be distributed to all laboratory animal examination organs (heart, liver, spleen, lung, kidney) and transcribed in the first day after injection. The short-term acute liver damage caused by rapid plasmid injection in tail vein was also demonstrated by the level of liver transaminase and the histomorphology of liver. It is proved that the system can safely and effectively mediate the long-term expression of foreign genes in animals.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R450;R3416

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