本文關(guān)鍵詞：黑暗鏈霉菌aprD3和aprD4基因的研究及卡那霉素B高產(chǎn)菌株的構(gòu)建　出處：《沈陽藥科大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：黑暗鏈霉菌主要產(chǎn)生氨甲酰妥布霉素、氨甲�？敲顾谺和安普霉素三種抗生素,氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B是4,6取代2-脫氧鏈霉胺類氨基糖苷抗生素,而安普霉素是4取代2-脫氧鏈霉胺類抗生素,且結(jié)構(gòu)中有一獨(dú)特的八碳糖。氨甲酰妥布霉素和氨甲�？敲顾谺結(jié)構(gòu)非常相似,差別只在氨甲酰卡那霉素B的C-3’位為羥基而氨甲酰妥布霉素C-3’位為氫,安普霉素雖然與它們結(jié)構(gòu)有較大差異,但其C-3’位也為氫。推測氨甲酰妥布霉素和氨甲�？敲顾谺為同一生物合成途徑合成,其生物合成基因簇為妥布霉素生物合成基因簇,而安普霉素有其獨(dú)立的生物合成途徑,妥布霉素生物合成基因簇和安普霉素生物合成基因簇均已經(jīng)被克隆。由于氨甲酰妥布霉素和安普霉素結(jié)構(gòu)中都有C-3’位脫氧結(jié)構(gòu),且前體的對應(yīng)位置為羥基,所以推測它們的生物合成途徑中有C-3’位脫氧這一過程。因此,通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)氨甲酰妥布霉素和安普霉素生物合成中C-3’脫氧有關(guān)的基因不僅可以為2-脫氧鏈霉胺類氨基糖苷抗生素的脫氧機(jī)制研究打下基礎(chǔ),而且可以在此基礎(chǔ)上通過基因工程的方法構(gòu)建只產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的組份優(yōu)化的菌株。對已經(jīng)報(bào)道的氨基糖苷類抗生素合成基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,推測安普霉素生物合成基因簇中的aprD3和aprD4可能參與安普霉素和妥布霉素生物合成中的脫氧。 為了研究aprD3基因的功能,通過基因阻斷試驗(yàn)對其進(jìn)行阻斷。以黑暗鏈霉菌H6總DNA為模板PCR擴(kuò)增同源片段,構(gòu)建阻斷質(zhì)粒。質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌H6,依次篩選單交換和雙交換菌株。與出發(fā)菌株相比,aprD3阻斷變株產(chǎn)生一新的抗生素。通過質(zhì)譜和核磁對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證,證實(shí)該新組分為氧化安普霉素,說明AprD3參與安普霉素生物合成中脫氧過程。AprD3是首個(gè)得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)的參與2-DOS類氨基糖苷類抗生素的脫氧結(jié)構(gòu)形成的酶。 通過基因阻斷試驗(yàn)對aprD4基因功能進(jìn)行研究,aprD4阻斷變株不再產(chǎn)生氨甲酰妥布霉素,而氨甲酰卡那霉素B的產(chǎn)量大幅度提升,同時(shí)產(chǎn)生氧化安普霉素,說明AprD4同時(shí)參與氨甲酰妥布霉素和安普霉素生物合成中脫氧過程。 氨甲酰卡那霉素B經(jīng)水解能夠得到卡那霉素B,卡那霉素B是合成抗生素地貝卡星和阿貝卡星的原料。如果能得到卡那霉素B組份優(yōu)化的高產(chǎn)菌株,將具有重大的應(yīng)用價(jià)值。為阻斷安普霉素和氨甲酰妥布霉素的合成,構(gòu)建基因阻斷質(zhì)粒,將黑暗鏈霉菌H6基因組刪除4.2kb片段,該片段包括完整的aprQ基因和aprD3、aprD4部分序列。對阻斷變株SPU313進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。阻斷變株只產(chǎn)生氨甲�？敲顾谺,而不再產(chǎn)生其他抗生素。對阻斷變株效價(jià)進(jìn)行測定,氨甲�？敲顾谺的產(chǎn)量是出發(fā)菌株H6的五倍。但氨甲酰卡那霉素B需經(jīng)水解才能得到卡那霉素B,為了直接發(fā)酵生產(chǎn)卡那霉素B,將負(fù)責(zé)氨甲�；D(zhuǎn)移的基因tacA進(jìn)行阻斷,從而得到了卡那霉素B高產(chǎn)菌株。證明通過基因工程方法不僅可以去除雜質(zhì)組分,而且可以得到原始菌株中不產(chǎn)生的目標(biāo)產(chǎn)物。
[Abstract]:The C - 3 ' deoxy chain was synthesized by means of gene engineering , but the C - 3 ' position was hydrogen . In order to study the function of aprD3 gene , it was blocked by means of gene block test . The gene function of aprD4 was studied by means of gene block test . The aprD4 blocked mutant no longer produced carbactobramycin , but the yield of carbamycamycin B was greatly improved , meanwhile , the production of oxapramycin was produced , which showed that AprD4 was simultaneously involved in the deoxidation process in the biosynthesis of carbactobramycin and apramycin . A high - yield strain of kanamycin B can be obtained by hydrolysis to obtain kanamycin B .

【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 許銘，

本文編號：1357151