本文關(guān)鍵詞：鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白A真核表達(dá)載體構(gòu)建及其誘導(dǎo)Hela細(xì)胞不完全自噬　出處：《免疫學(xué)雜志》2017年11期 　論文類(lèi)型：期刊論文

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【摘要】：目的構(gòu)建鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)的真核表達(dá)載體pEGFP-OmpA,研究OmpA對(duì)Hela細(xì)胞自噬的影響。方法采用PCR方法擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606的OmpA基因,將其克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1,以構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-OmpA;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光和Western blot檢測(cè)OmpA表達(dá)水平;激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)OmpA在Hela細(xì)胞中的定位;Western blot及透射電子顯微鏡檢測(cè)OmpA對(duì)Hela細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定表明pEGFP-OmpA質(zhì)粒構(gòu)建成功;OmpA可以大量表達(dá)于Hela細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中;OmpA可導(dǎo)致Hela細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ、p62和Beclin-1表達(dá)升高,而且在Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)自噬小體;OmpA會(huì)干擾p62降解,引發(fā)不完全自噬。結(jié)論本研究成功構(gòu)建pEGFP-OmpA真核表達(dá)載體,它可以在Hela細(xì)胞中高效表達(dá),并可導(dǎo)致Hela細(xì)胞不完全自噬,這為將來(lái)進(jìn)一步研究鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA引起自噬的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct Bauman Acinetobacter ATCC19606 (Acinetobacter baumannii ATCC A (19606) outer membrane protein outer membrane protein A, OmpA) the eukaryotic expression vector pEGFP-OmpA. The effects of OmpA on autophagy in Hela cells. Methods OmpA gene amplification Bauman real coli ATCC19606 by PCR method, then cloned into eukaryotic expression vector pEGFP-N1. To construct the recombinant plasmid pEGFP-OmpA; liposome transfected into Hela cells; flow cytometry, cell immunofluorescence and Western blot detected the expression level of OmpA; detection OmpA laser scanning confocal microscope in Hela cells; OmpA Western blot influence the detection and transmission electron microscopy of autophagy in Hela cells. Results the double enzyme digestion and sequencing showed that the pEGFP-OmpA plasmid was successfully constructed; OmpA can be expressed in Hela cell cytoplasm and nucleus; OmpA can induce Hela cell autophagy. Protein LC3B II, p62 and Beclin-1 expression increased, and that of autophagosomes in Hela cells; OmpA may interfere with the degradation of p62, caused by incomplete autophagy. Conclusion this study has successfully constructed the eukaryotic expression vector pEGFP-OmpA, which can be efficiently expressed in Hela cells, and Hela cells can lead to incomplete autophagy, which for the future further study of Bauman Acinetobacter OmpA autophagy mechanism caused by the foundation.

【作者單位】： 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科;
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【正文快照】： 鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵的革蘭氏陰性條件致病菌,它通常感染免疫力低下的人群,可以導(dǎo)致肺炎、菌血癥、泌尿系感染、腦膜炎等感染性疾病[1]。近年來(lái),由于抗生素的濫用,產(chǎn)生了耐碳青霉烯的鮑曼不動(dòng)桿菌,甚至出現(xiàn)了泛耐藥和全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,這給臨床治療帶來(lái)了極大困難[2]。

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