本文關(guān)鍵詞：FcγRs在ITP中的表達(dá)及調(diào)控研究　出處：《山東大學(xué)》2011年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 免疫性血小板減少癥 Fcγ受體 大劑量地塞米松

【摘要】：研究背景： 人Fcγ受體系統(tǒng)由活化性受體(FcγRⅠ,Ⅱa,Ⅲ)和抑制性受體(FcγRⅡb)兩個(gè)家族組成,這兩類(lèi)作用相反的受體平衡一旦失調(diào)會(huì)導(dǎo)致許多自身免疫性疾病的發(fā)生�？乖�-IgG免疫復(fù)合物(immune complex, IC)通過(guò)作用于免疫細(xì)胞上IgG恒定區(qū)Fcγ受體誘發(fā)多種免疫反應(yīng)。根據(jù)RNA剪接異構(gòu)體和蛋白結(jié)構(gòu)不同,人類(lèi)FcγR系統(tǒng)可分為FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ三個(gè)亞群。FcγRⅠ又稱CD64,為高親和力的IgG受體,主要表達(dá)與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；FcγRⅢ即CD16,與單體IgG結(jié)合力較弱,但同IgG聚合體有中低度的親和力,其主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞；FcγRⅡ又稱CD32,按功能可進(jìn)一步分為FcγRⅡa和FcγRⅡb兩個(gè)亞型,為低到中親和力的IgG受體,主要與聚合的IgG結(jié)合,表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)、B細(xì)胞和血小板。按功能學(xué)分類(lèi),人FcγR系統(tǒng)可分為活化性FcγR和抑制性FcγR兩個(gè)家族。FcγRⅡb為唯一抑制性的Fcγ受體,主要通過(guò)自身分子胞漿區(qū)偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)傳遞抑制信號(hào),在固有免疫和適應(yīng)性免疫方面發(fā)揮重要負(fù)性調(diào)節(jié)作用；其余的FcγRⅠ、Ⅱa、Ⅲ均為活化性Fcγ受體,大都通過(guò)偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motif, IT AM)的γ二聚體傳遞活化信號(hào)。Fcγ受體信號(hào)通路在多種自身免疫性疾病的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。多篇報(bào)道顯示：在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)等自身免疫性疾病中,往往可以發(fā)現(xiàn)活化性受體FcyRI的表達(dá)下調(diào)及抑制性受體FcyRIIb的表達(dá)上調(diào),故活化性和抑制性Fcy受體失衡在自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia, ITP),以往亦稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP),是臨床最為常見(jiàn)的出血性疾病,約占出血性疾病總數(shù)的30%。ITP臨床表現(xiàn)為皮膚粘膜出血,月經(jīng)過(guò)多,內(nèi)臟出血,甚至顱內(nèi)出血,嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。其發(fā)病機(jī)制主要為機(jī)體自身免疫耐受失衡,產(chǎn)生了針對(duì)血小板糖蛋白(glycoprotein, GP)特異性的自身抗體,大部分主要為針對(duì)GPⅡb/Ⅲa和／或GPⅠb/Ⅸ的IgG,該抗體與血小板膜自身GP抗原結(jié)合,通過(guò)作用于單核巨噬細(xì)胞Fcy受體(Fcγreceptor, FcyR)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被巨噬細(xì)胞吞噬而過(guò)度清除。自身抗體的產(chǎn)生、激活、維持由表達(dá)FcγR的免疫細(xì)胞共同參與完成,是眾多自身免疫性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。除上述經(jīng)典的抗體介導(dǎo)的血小板異常破壞途徑外,多種細(xì)胞免疫機(jī)制異常,如Th1/Th2失衡、Th17亞群異常、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介導(dǎo)的血小板破壞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量或抑制功能異常等參與了ITP發(fā)病的異常病理生理過(guò)程,但上述異常的具體原因亟待明確。目前,對(duì)于ITP的治療以糖皮質(zhì)激素、脾切除、大劑量丙種球蛋白、免疫抑制劑等治療為主,容易產(chǎn)生感染、骨髓抑制等副作用,約有1/3的患者對(duì)上述治療無(wú)效,成為難治性ITP,常常遷延不愈,甚至危及生命。因此,深入了解ITP的發(fā)病機(jī)制,探討阻斷ITP特異發(fā)病途徑并尋找新的藥物作用靶點(diǎn)對(duì)展新的ITP的治療策略有重要意義 ITP是最經(jīng)典的一種Fcy受體介導(dǎo)的自身免疫性出血性疾病。做為FcγRs系統(tǒng)中唯一的抑制性受體,FcγRⅡb在ITP的免疫負(fù)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Ashi最近報(bào)道顯示：對(duì)清除幽門(mén)螺桿菌療法有反應(yīng)的ITP患者中,可以發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞抑制性受體FcγRⅡb的表達(dá)上調(diào)及活化性受體FcγRⅡa、FcyRⅠ的表達(dá)下調(diào),而清除幽門(mén)螺桿菌療法無(wú)反應(yīng)的ITP患者中并不伴有該種變化,這提示幽門(mén)螺桿菌清除后可以通過(guò)恢復(fù)FcγRs受體平衡來(lái)緩解ITP病情。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)：過(guò)表達(dá)FcγRⅡa的轉(zhuǎn)基因小鼠可顯著加重抗體介導(dǎo)的血小板減少。此外,FcγRⅡa、Ⅱb亦參與抗體、補(bǔ)體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)：Shushakova研究顯示C5a可直接上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞FcγRⅡb的表達(dá)。小鼠模型中,可溶性抗原特異的IgG可成功治療ITP。大劑量丙種球蛋白靜脈滴注(intravenous immunoglobulin, IVIg)已成功用于人類(lèi)包括ITP在內(nèi)的多種自身免疫性疾病中,且療效機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)IVI可上調(diào)抑制性FcγyRⅡb活性并下調(diào)激活性FcγRⅡa活性�？诜髣┝康厝姿�(high dose dexamethasone, HD-DXM)沖擊療法是當(dāng)前皮質(zhì)激素治療ITP的研究熱點(diǎn),其療效逐漸得到了廣泛認(rèn)可,尤其是治療初治ITP患者。最近ITP國(guó)際工作組已將HD-DXM作為初診ITP的標(biāo)準(zhǔn)一線療法,但其療效的具體機(jī)制尚不明確。初步研究證實(shí)：它可抑制抗體生成及減輕抗原抗體反應(yīng)、改善毛細(xì)血管通透性、刺激骨髓造血及血小板向外周血的釋放、恢復(fù)Th1/Th2平衡、增加Tregs數(shù)量等。迄今為止,尚未有系統(tǒng)的關(guān)于ITP患者與健康對(duì)照外周單核及B細(xì)胞上FcγRs表達(dá)及HD-DXM對(duì)ITP患者Fcγ受體系統(tǒng)影響的報(bào)道。 目的： 檢測(cè)初診活動(dòng)性ITP患者及健康對(duì)照外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達(dá)及FcγRⅡ的亞型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表達(dá)；研究HD-DXM治療后ITP患者FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表達(dá)變化、FcγRIIa/IIb mRNA及蛋白表達(dá)變化；檢測(cè)ITP患者治療前后單核／巨噬細(xì)胞對(duì)致敏自身血小板吞噬能力變化及Th1/Th2細(xì)胞因子平衡變化；體外檢測(cè)ITP患者單核細(xì)胞在DXM存在情況下培養(yǎng)時(shí)FcγRⅡa/Ⅱb mRNA表達(dá)變化,探討HD-DXM影響FcγRs系統(tǒng)變化的可能機(jī)制。 材料和方法： (1)外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達(dá)及FcγRⅡ的亞型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)部分,抽取23例初診活動(dòng)性ITP患者治療前、治療后2周及20例健康對(duì)照的外周血,分離血漿及單個(gè)核細(xì)胞。 (2)流式細(xì)胞儀染色法測(cè)定外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達(dá)；免疫磁珠陽(yáng)性分選外周血CD14+單核細(xì)胞；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)檢測(cè)單核細(xì)胞FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表達(dá)；免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)和western blotting檢測(cè)FcγRⅡa、Ⅱb的蛋白表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)檢測(cè)ITP治療前后及正常對(duì)照血漿中IFN-γ、IL-4的水平。 (3)體外實(shí)驗(yàn)部分抽取14例治療前ITP患者外周血做細(xì)胞培養(yǎng)。免疫磁珠陽(yáng)性分選外周血CD14+單核細(xì)胞,加入不同劑量的DXM培養(yǎng)16h, real-time RT-PCR檢測(cè)FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表達(dá)變化； (4)抽取10例健康對(duì)照、10例ITP患者治療前及治療2周后外周血,貼壁法分離外周血單核細(xì)胞并刺激,與CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)探針標(biāo)記過(guò)的致敏自身血小板在37°C或4°C共培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板被自身單核／巨噬細(xì)胞吞噬情況,應(yīng)用MFI37℃/MFI4℃做為吞噬指數(shù)以判定吞噬能力。 結(jié)果： (1)流式測(cè)定的FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ表面分子表達(dá)高低以平均熒光強(qiáng)度表示(mean fluorescence intensity, MFI),結(jié)果顯示：①初診ITP患者單核細(xì)胞表面分子FcγRⅠ表達(dá)(504.6±58.6)顯著高于正常對(duì)照(309.8±52.9；P0.001)；經(jīng)HD-DXM治療后2周,FcγRⅠ表達(dá)較治療前顯著降低(317.5±69.4；P0.001)：FcγRⅠ在治療后與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05)。②單核細(xì)胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ在ITP組治療前(FcγRⅡ82.6±160; FcγRⅢ9.9±4.6)、治療后(FcγRⅡ75.4±18.9; FcγRⅢ8.9±3.0)及正常對(duì)照組(FcγRⅡ83.2±16.3; FcγRⅢ9.3±3.2)之間無(wú)顯著差異(FcγRⅡP=0.947; FcγRⅢP=0.694; ANOVA).③B細(xì)胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)在ITP組治療前(82.3±13.0)治療后(82.7±11.8)及正常對(duì)照組(83.2±12.1)之間差異無(wú)顯著性(P=0.954；ANOVA). (2)單核細(xì)胞FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA和蛋白表達(dá)：①real-time RT-PCR結(jié)果：我們應(yīng)用FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA的比率變化表示HD-DXM對(duì)FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA表達(dá)的影響。初診ITP患者FcγRⅡa/Ⅱb mRNA的比率值為5.88±5.12,與正常對(duì)照組存在顯著差異(0.31±0.29；P0.001)；接受HD-DXM治療后FcγRⅡa/Ⅱb mRNA的比率值(0.61±0.86)較治療前顯著降低(P0.001)。②western blotting結(jié)果：應(yīng)用相對(duì)光密度值高低來(lái)代表FcγRⅡa和FcγRⅡb蛋白表達(dá)量。初診ITP患者單核細(xì)胞FcγRⅡa表達(dá)量接受HD-DXM治療后顯著降低(2.05±0.81 vs 1.07±0.96, P 0.001, Student(?) test),并伴有FcγRⅡb表達(dá)的顯著升高(0.13±0.31 vs 1.23±1.25, P 0.001, Whitney U test) (3)ITP患者HD-DXM治療后單核／巨噬細(xì)胞FcγR介導(dǎo)的吞噬致敏血小板能力的改變。應(yīng)用CMFDA做探針標(biāo)記血小板,初診ITP患者吞噬指數(shù)為(MFI ratio:3.5±0.7),顯著高于正常對(duì)照(2.2±0.5；P0.05)。HD-DXM治療后吞噬指數(shù)降為(MFI ratio:2.6±1.0),較治療前有顯著差異(P0.05)。 (4)ITP患者治療前后血漿IFN-γ、IL-4水平變化。初診ITP患者治療前Thl系列細(xì)胞因子IFN-γ較正常對(duì)照顯著增高(62.7±13.0 vs 37.4±4.8 pg/ml, P 0.001)和IL-4的顯著降低(8.9±2.7 vs 18.3±4.7 pg/ml, P 0.001). HD-DXM治療后,IFN-γ水平較治療前顯著降低并伴有IL-4的顯著升高(IFN-γ:40.3±11.0 pg/ml, P 0.001; IL-4:18.5±4.2 pg/ml, P 0.001). (5)DXM對(duì)ITP患者體外培養(yǎng)單核細(xì)胞FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表達(dá)的影響。體外培養(yǎng)ITP患者的單核細(xì)胞在加入DXM后出現(xiàn)FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表達(dá)的同時(shí)上調(diào),這種效應(yīng)在DXM為1μM時(shí)最明顯。在DXM為0.5μM和1μM時(shí),FcγRⅡb mRNA表達(dá)上調(diào)的幅度要高于FcγRⅡa的幅度(P0.05)。 結(jié)論： (1)初診活動(dòng)性ITP患者外周血單核細(xì)胞呈現(xiàn)活化性FcγRⅠ、FcγRⅡa的表達(dá)升高,及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表達(dá)降低； (2)ITP患者經(jīng)HD-DXM治療后2周,單核細(xì)胞出現(xiàn)活化性FcγRL、FcγRIIa的表達(dá)降低,及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表達(dá)升高,FcγRⅡa/Ⅱb mRNA比率恢復(fù)正常； (3)ITP患者治療后伴隨著單核細(xì)胞活化性和抑制性FcγRs受體平衡恢復(fù),單核／巨噬細(xì)胞FcγR介導(dǎo)的自體致敏血小板吞噬能力降低； (4)ITP患者呈現(xiàn)Th1細(xì)胞極化狀態(tài),經(jīng)HD-DXM治療后,Th1/Th2失衡狀態(tài)得到糾正； (5)DXM在體外可同時(shí)上調(diào)FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表達(dá),且FcγRⅡb上調(diào)幅度更高； 意義：本研究揭示HD-DXM治療可以通過(guò)上調(diào)抑制性FcγRⅡb恢復(fù)單核細(xì)胞FcγRs系統(tǒng)平衡,從而緩解ITP患者癥狀,這提示了HD-DXM在ITP中發(fā)揮療效的一種新的可能機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 秦平,侯明,孫建芝,蘆璐,石艷,朱媛媛,李麗珍,張茂宏;直接MAIPA對(duì)免疫性和非免疫性血小板減少性紫癜的鑒別診斷[J];中華血液學(xué)雜志;2005年03期

2 衣翠華;侯明;朱媛媛;秦平;;血小板相關(guān)抗體IgG初篩不能提高單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原對(duì)免疫性血小板減少性紫癜診斷的敏感性[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

3 朱霞;朱平;郭曉玲;;慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜相關(guān)T細(xì)胞克隆的T細(xì)胞受體特征[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年47期

，

本文編號(hào)：1356650