本文關鍵詞：FcγRs在ITP中的表達及調(diào)控研究　出處：《山東大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景： 人Fcγ受體系統(tǒng)由活化性受體(FcγRⅠ,Ⅱa,Ⅲ)和抑制性受體(FcγRⅡb)兩個家族組成,這兩類作用相反的受體平衡一旦失調(diào)會導致許多自身免疫性疾病的發(fā)生�？乖�-IgG免疫復合物(immune complex, IC)通過作用于免疫細胞上IgG恒定區(qū)Fcγ受體誘發(fā)多種免疫反應。根據(jù)RNA剪接異構體和蛋白結構不同,人類FcγR系統(tǒng)可分為FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ三個亞群。FcγRⅠ又稱CD64,為高親和力的IgG受體,主要表達與單核細胞和巨噬細胞；FcγRⅢ即CD16,與單體IgG結合力較弱,但同IgG聚合體有中低度的親和力,其主要表達于中性粒細胞、單核／巨噬細胞、自然殺傷細胞；FcγRⅡ又稱CD32,按功能可進一步分為FcγRⅡa和FcγRⅡb兩個亞型,為低到中親和力的IgG受體,主要與聚合的IgG結合,表達于中性粒細胞、單核／巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)、B細胞和血小板。按功能學分類,人FcγR系統(tǒng)可分為活化性FcγR和抑制性FcγR兩個家族。FcγRⅡb為唯一抑制性的Fcγ受體,主要通過自身分子胞漿區(qū)偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)傳遞抑制信號,在固有免疫和適應性免疫方面發(fā)揮重要負性調(diào)節(jié)作用；其余的FcγRⅠ、Ⅱa、Ⅲ均為活化性Fcγ受體,大都通過偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motif, IT AM)的γ二聚體傳遞活化信號。Fcγ受體信號通路在多種自身免疫性疾病的發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用。多篇報道顯示：在風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)等自身免疫性疾病中,往往可以發(fā)現(xiàn)活化性受體FcyRI的表達下調(diào)及抑制性受體FcyRIIb的表達上調(diào),故活化性和抑制性Fcy受體失衡在自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。 原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia, ITP),以往亦稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP),是臨床最為常見的出血性疾病,約占出血性疾病總數(shù)的30%。ITP臨床表現(xiàn)為皮膚粘膜出血,月經(jīng)過多,內(nèi)臟出血,甚至顱內(nèi)出血,嚴重影響人類健康。其發(fā)病機制主要為機體自身免疫耐受失衡,產(chǎn)生了針對血小板糖蛋白(glycoprotein, GP)特異性的自身抗體,大部分主要為針對GPⅡb/Ⅲa和／或GPⅠb/Ⅸ的IgG,該抗體與血小板膜自身GP抗原結合,通過作用于單核巨噬細胞Fcy受體(Fcγreceptor, FcyR)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被巨噬細胞吞噬而過度清除。自身抗體的產(chǎn)生、激活、維持由表達FcγR的免疫細胞共同參與完成,是眾多自身免疫性疾病的共同病理生理基礎。除上述經(jīng)典的抗體介導的血小板異常破壞途徑外,多種細胞免疫機制異常,如Th1/Th2失衡、Th17亞群異常、細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介導的血小板破壞、調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量或抑制功能異常等參與了ITP發(fā)病的異常病理生理過程,但上述異常的具體原因亟待明確。目前,對于ITP的治療以糖皮質(zhì)激素、脾切除、大劑量丙種球蛋白、免疫抑制劑等治療為主,容易產(chǎn)生感染、骨髓抑制等副作用,約有1/3的患者對上述治療無效,成為難治性ITP,常常遷延不愈,甚至危及生命。因此,深入了解ITP的發(fā)病機制,探討阻斷ITP特異發(fā)病途徑并尋找新的藥物作用靶點對展新的ITP的治療策略有重要意義 ITP是最經(jīng)典的一種Fcy受體介導的自身免疫性出血性疾病。做為FcγRs系統(tǒng)中唯一的抑制性受體,FcγRⅡb在ITP的免疫負性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Ashi最近報道顯示：對清除幽門螺桿菌療法有反應的ITP患者中,可以發(fā)現(xiàn)單核細胞抑制性受體FcγRⅡb的表達上調(diào)及活化性受體FcγRⅡa、FcyRⅠ的表達下調(diào),而清除幽門螺桿菌療法無反應的ITP患者中并不伴有該種變化,這提示幽門螺桿菌清除后可以通過恢復FcγRs受體平衡來緩解ITP病情。動物實驗亦證實：過表達FcγRⅡa的轉(zhuǎn)基因小鼠可顯著加重抗體介導的血小板減少。此外,FcγRⅡa、Ⅱb亦參與抗體、補體介導的炎癥反應：Shushakova研究顯示C5a可直接上調(diào)肺泡巨噬細胞FcγRⅡb的表達。小鼠模型中,可溶性抗原特異的IgG可成功治療ITP。大劑量丙種球蛋白靜脈滴注(intravenous immunoglobulin, IVIg)已成功用于人類包括ITP在內(nèi)的多種自身免疫性疾病中,且療效機制研究發(fā)現(xiàn)IVI可上調(diào)抑制性FcγyRⅡb活性并下調(diào)激活性FcγRⅡa活性�？诜髣┝康厝姿�(high dose dexamethasone, HD-DXM)沖擊療法是當前皮質(zhì)激素治療ITP的研究熱點,其療效逐漸得到了廣泛認可,尤其是治療初治ITP患者。最近ITP國際工作組已將HD-DXM作為初診ITP的標準一線療法,但其療效的具體機制尚不明確。初步研究證實：它可抑制抗體生成及減輕抗原抗體反應、改善毛細血管通透性、刺激骨髓造血及血小板向外周血的釋放、恢復Th1/Th2平衡、增加Tregs數(shù)量等。迄今為止,尚未有系統(tǒng)的關于ITP患者與健康對照外周單核及B細胞上FcγRs表達及HD-DXM對ITP患者Fcγ受體系統(tǒng)影響的報道。 目的： 檢測初診活動性ITP患者及健康對照外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達及FcγRⅡ的亞型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表達；研究HD-DXM治療后ITP患者FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表達變化、FcγRIIa/IIb mRNA及蛋白表達變化；檢測ITP患者治療前后單核／巨噬細胞對致敏自身血小板吞噬能力變化及Th1/Th2細胞因子平衡變化；體外檢測ITP患者單核細胞在DXM存在情況下培養(yǎng)時FcγRⅡa/Ⅱb mRNA表達變化,探討HD-DXM影響FcγRs系統(tǒng)變化的可能機制。 材料和方法： (1)外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達及FcγRⅡ的亞型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表達檢測部分,抽取23例初診活動性ITP患者治療前、治療后2周及20例健康對照的外周血,分離血漿及單個核細胞。 (2)流式細胞儀染色法測定外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達；免疫磁珠陽性分選外周血CD14+單核細胞；實時定量聚合酶鏈反應(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)檢測單核細胞FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表達；免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)和western blotting檢測FcγRⅡa、Ⅱb的蛋白表達；酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)檢測ITP治療前后及正常對照血漿中IFN-γ、IL-4的水平。 (3)體外實驗部分抽取14例治療前ITP患者外周血做細胞培養(yǎng)。免疫磁珠陽性分選外周血CD14+單核細胞,加入不同劑量的DXM培養(yǎng)16h, real-time RT-PCR檢測FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表達變化； (4)抽取10例健康對照、10例ITP患者治療前及治療2周后外周血,貼壁法分離外周血單核細胞并刺激,與CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)探針標記過的致敏自身血小板在37°C或4°C共培養(yǎng),流式細胞儀檢測血小板被自身單核／巨噬細胞吞噬情況,應用MFI37℃/MFI4℃做為吞噬指數(shù)以判定吞噬能力。 結果： (1)流式測定的FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ表面分子表達高低以平均熒光強度表示(mean fluorescence intensity, MFI),結果顯示：①初診ITP患者單核細胞表面分子FcγRⅠ表達(504.6±58.6)顯著高于正常對照(309.8±52.9；P0.001)；經(jīng)HD-DXM治療后2周,FcγRⅠ表達較治療前顯著降低(317.5±69.4；P0.001)：FcγRⅠ在治療后與正常對照組無顯著差異(P0.05)。②單核細胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ在ITP組治療前(FcγRⅡ82.6±160; FcγRⅢ9.9±4.6)、治療后(FcγRⅡ75.4±18.9; FcγRⅢ8.9±3.0)及正常對照組(FcγRⅡ83.2±16.3; FcγRⅢ9.3±3.2)之間無顯著差異(FcγRⅡP=0.947; FcγRⅢP=0.694; ANOVA).③B細胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)在ITP組治療前(82.3±13.0)治療后(82.7±11.8)及正常對照組(83.2±12.1)之間差異無顯著性(P=0.954；ANOVA). (2)單核細胞FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA和蛋白表達：①real-time RT-PCR結果：我們應用FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA的比率變化表示HD-DXM對FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA表達的影響。初診ITP患者FcγRⅡa/Ⅱb mRNA的比率值為5.88±5.12,與正常對照組存在顯著差異(0.31±0.29；P0.001)；接受HD-DXM治療后FcγRⅡa/Ⅱb mRNA的比率值(0.61±0.86)較治療前顯著降低(P0.001)。②western blotting結果：應用相對光密度值高低來代表FcγRⅡa和FcγRⅡb蛋白表達量。初診ITP患者單核細胞FcγRⅡa表達量接受HD-DXM治療后顯著降低(2.05±0.81 vs 1.07±0.96, P 0.001, Student(?) test),并伴有FcγRⅡb表達的顯著升高(0.13±0.31 vs 1.23±1.25, P 0.001, Whitney U test) (3)ITP患者HD-DXM治療后單核／巨噬細胞FcγR介導的吞噬致敏血小板能力的改變。應用CMFDA做探針標記血小板,初診ITP患者吞噬指數(shù)為(MFI ratio:3.5±0.7),顯著高于正常對照(2.2±0.5；P0.05)。HD-DXM治療后吞噬指數(shù)降為(MFI ratio:2.6±1.0),較治療前有顯著差異(P0.05)。 (4)ITP患者治療前后血漿IFN-γ、IL-4水平變化。初診ITP患者治療前Thl系列細胞因子IFN-γ較正常對照顯著增高(62.7±13.0 vs 37.4±4.8 pg/ml, P 0.001)和IL-4的顯著降低(8.9±2.7 vs 18.3±4.7 pg/ml, P 0.001). HD-DXM治療后,IFN-γ水平較治療前顯著降低并伴有IL-4的顯著升高(IFN-γ:40.3±11.0 pg/ml, P 0.001; IL-4:18.5±4.2 pg/ml, P 0.001). (5)DXM對ITP患者體外培養(yǎng)單核細胞FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表達的影響。體外培養(yǎng)ITP患者的單核細胞在加入DXM后出現(xiàn)FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表達的同時上調(diào),這種效應在DXM為1μM時最明顯。在DXM為0.5μM和1μM時,FcγRⅡb mRNA表達上調(diào)的幅度要高于FcγRⅡa的幅度(P0.05)。 結論： (1)初診活動性ITP患者外周血單核細胞呈現(xiàn)活化性FcγRⅠ、FcγRⅡa的表達升高,及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表達降低； (2)ITP患者經(jīng)HD-DXM治療后2周,單核細胞出現(xiàn)活化性FcγRL、FcγRIIa的表達降低,及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表達升高,FcγRⅡa/Ⅱb mRNA比率恢復正常； (3)ITP患者治療后伴隨著單核細胞活化性和抑制性FcγRs受體平衡恢復,單核／巨噬細胞FcγR介導的自體致敏血小板吞噬能力降低； (4)ITP患者呈現(xiàn)Th1細胞極化狀態(tài),經(jīng)HD-DXM治療后,Th1/Th2失衡狀態(tài)得到糾正； (5)DXM在體外可同時上調(diào)FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表達,且FcγRⅡb上調(diào)幅度更高； 意義：本研究揭示HD-DXM治療可以通過上調(diào)抑制性FcγRⅡb恢復單核細胞FcγRs系統(tǒng)平衡,從而緩解ITP患者癥狀,這提示了HD-DXM在ITP中發(fā)揮療效的一種新的可能機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 秦平,侯明,孫建芝,蘆璐,石艷,朱媛媛,李麗珍,張茂宏;直接MAIPA對免疫性和非免疫性血小板減少性紫癜的鑒別診斷[J];中華血液學雜志;2005年03期

2 衣翠華;侯明;朱媛媛;秦平;;血小板相關抗體IgG初篩不能提高單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原對免疫性血小板減少性紫癜診斷的敏感性[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2007年03期

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本文編號：1356650