本文關(guān)鍵詞：抗TRPC6多肽單克隆抗體的制備、鑒定及其初步應(yīng)用　出處：《廣東藥學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：1研究目的與意義 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱酥苽淇筎RPC6多肽單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立單抗-單抗夾心ELISA法測定體系。研究的意義在于所建立的ELISA測定體系用于各種組織和細(xì)胞中TRPC6蛋白過表達(dá)的測定，并可以進(jìn)一步輔助局灶節(jié)段性腎小球硬化(Focal Segmental Glomerulo Sclerosis, FSGS)的診斷；所制備的單克隆抗體能廣泛應(yīng)用于免疫標(biāo)記技術(shù)（如金標(biāo)記、熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記等），因此，本研究不論在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域還是臨床診療技術(shù)中均有著重要的應(yīng)用價值。 2研究的主要內(nèi)容、方法和結(jié)果 2.1TRPC6多肽設(shè)計與合成 瞬時受體電位陽離子通道6(Transient Receptor Potential Channel, TRPC6)是由931個氨基酸組成的六次跨膜結(jié)構(gòu)的通道蛋白。根據(jù)多肽設(shè)計原則，利用蛋白質(zhì)軟件分析方法，從5段氨基酸序列中篩選出序列-KDLTKVTLGDNVKYY，該序列為15個氨基酸，為TRPC6分子中的565-579段序列，其在抗原性、親水性、柔韌性及結(jié)構(gòu)分析上均符合設(shè)計要求，多肽經(jīng)合成后純度＞98%，在與鑰孔嘁藍(lán)蛋白（KLH）進(jìn)行偶聯(lián)后，成為制備單克隆抗體的免疫原。 2.2抗TRPC6多肽單克隆抗體的制備與鑒定 利用偶聯(lián)后的TRPC6多肽抗原免疫Balb/c小鼠，三次免疫，通過間接ELISA法檢測血清免疫效價，選取免疫效價高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。采用聚乙二醇法將免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞（P3-X63-Ag8.653）融合，用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，，克隆生長孔用間接ELISA法檢測上清效價，篩選出陽性克隆，再經(jīng)過三次有限稀釋法克隆化，初步得到7株陽性率100%的分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為A2、D8、E9、G3、G11、H8和F11。在此基礎(chǔ)上經(jīng)過反復(fù)篩選建立雜交瘤細(xì)胞系，最終得到分泌抗體穩(wěn)定的三株雜交瘤細(xì)胞系，分別為A2、H8和F11，經(jīng)鑒定A2、H8和F11均為IgG1類，輕鏈類型均為κ型；3株腹水純化后效價分別為A2（1:1600）、H8（1:3200）和F11（1:1600），純化后濃度A2為4.1mg/ml，H8為1.04mg/ml，F(xiàn)11為1.03mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果，重鏈分子量約55KD，輕鏈分子量約為25KD，Bandscan軟件分析三株純度均大于90%；相對親和力測定結(jié)果可見H8和F11相近，均為6μg/ml，A2的相對親和力較低，為12.5μg/ml；單克隆抗體相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H8和F11為針對相同的抗原表位，A2與H8、F11均為針對不同抗原表位，通過配對實(shí)驗(yàn)確定A2和F11為最佳配對方案，并進(jìn)行雙抗體夾心法ELISA體系的構(gòu)建。 2.3雙抗體ELISA法體系的建立及初步應(yīng)用 在確定以A2和F11作為最佳配對的基礎(chǔ)上建立雙抗體夾心ELISA法檢測方法，初步應(yīng)用于檢測大鼠腦部TRPC6蛋白表達(dá)水平。為了確定最佳包被抗體量和酶標(biāo)抗體量，首先采用cELISA試驗(yàn)鑒定單抗的敏感性，F(xiàn)11的IC50為0.6μg/ml，A2的IC50為2.8μg/ml，說明F11的靈敏度要高于A2。 采用方陣滴定法確定包被A2的最佳濃度為1:200，5μg/ml，HRP-F11的最佳濃度為雙抗體的最佳稀釋濃度為1:150，7μg/ml；采用雙抗體夾心ELISA法建立檢測TRPC6蛋白水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.625μg/ml-10μg/ml范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，回歸方程為y=0.0519x+0.1869，相關(guān)系數(shù)R2=0.992，P0.05，說明本實(shí)驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA法檢測蛋白水平是可靠的，但最佳反應(yīng)條件還需要進(jìn)一步優(yōu)化和多樣本的檢測。通過建立的雙抗體夾心ELISA方法測定大鼠腦蛋白中TRPC6含量，用于組織細(xì)胞中TRPC6蛋白過表達(dá)的檢測。 3通過以上實(shí)驗(yàn)，可得以下結(jié)論 3.1通過抗原性、親水性和柔韌性等比較，最終篩選出KDLTKVTLGDNVKYY作為TRPC6多肽合成序列，合成多肽與KLH偶聯(lián)后可用于免疫動物的免疫原。 3.2通過合成肽抗原免疫小鼠制備了抗TRPC6多肽單克隆抗體，并建立了三株雜交瘤細(xì)胞系（A2、F11、H8），其中H8與F11的相對親和力相似，而且均大于A2，經(jīng)抗體相加實(shí)驗(yàn)得出H8與F11針對相同抗原位點(diǎn)，而其中F11與A2針對不同抗原位點(diǎn)，因此可用于雙抗體夾心ELISA方法的構(gòu)建。 3.3初步建立了檢測TRPC6蛋白的雙抗體夾心法，該方法可初步應(yīng)用于組織細(xì)胞中TRPC6蛋白過表達(dá)的檢測。
[Abstract]:1 Study Purpose and Significance The purpose of this study was to prepare the monoclonal antibody against TRPC6 polypeptide and to establish a single - antibody - McAb sandwich ELISA assay . The significance of this study was that the established ELISA assay was used for the determination of TRPC6 protein overexpression in various tissues and cells , and it could be used in the diagnosis of focal segmental glomerulosclerosis ( FSGS ) . 2 Main contents , methods and results of the study 2.1 TRPC6 polypeptide design and synthesis Transient receptor Potential Channel ( TRPC6 ) is a channel protein of six transmembrane structures composed of 931 amino acids . According to the principle of polypeptide design , the sequence - KDLTKVTLGDNVKYY is screened from the amino acid sequence of 5 segments . 2.2 Preparation and identification of monoclonal antibodies against TRPC6 polypeptide Three hybridoma cell lines ( A2 , 8 , 9 8 , 9 8 , 3 , 1 : 1600 ) were screened by indirect ELISA . The results showed that the two hybridoma cell lines were identified as A2 , 8 , 9 8 , 8 9 , 3 3 , 1 . 3 mg / ml . The results showed that the two hybridoma cell lines with the highest positive rate were A2 ( 1 : 1600 ) , 8 8 ( 1 : 3200 ) and F11 ( 1 : 1600 ) . The results showed that the two hybridoma cell lines with the highest positive rate were identified as A2 , 8 , 9 , 9 , 11 , 12 . 5 渭g / ml . 2.3 Establishment and Preliminary Application of Double - antibody ELISA System In order to determine the optimum amount of antibody and the amount of antibody , the IC50 of F11 was 0.6 渭g / ml , the IC50 of F11 was 2.8 渭g / ml , and the sensitivity of F11 was higher than A2 . The optimal concentration of HRP - F11 was 1 鈭

本文編號：1356029