本文關(guān)鍵詞：NR1-TfR融合表位疫苗的制備及免疫反應(yīng)的實驗研究　出處：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：谷氨酸N－甲基－D－天冬氨酸受體(N-Methyl-D-Asparate Receptor，NR)廣泛參與神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶、缺血性腦損傷和癲癇等生理病理過程，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用。目前己知的NR拮抗劑或阻斷劑大部分是人工合成的小分子藥物，容易通過血腦屏障（Blood-brain barrier,BBB）；但其作用選擇性低、常引起嚴(yán)重毒副作用：意識模糊、焦慮不安、幻覺等，并且難以超早期用藥，因此難以進(jìn)入臨床。NR1是NR的基本功能亞單位，，具有NR的所有電生理和藥理學(xué)特性。抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體OX26被認(rèn)為是迄今最有前途的腦轉(zhuǎn)運載體，NR1抗體借助轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin receptor,TfR）可能可以透過血腦屏障在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮干預(yù)治療作用。因此NR1-TfR重組基因口服疫苗有望成超早期治療腦損傷、機(jī)體應(yīng)激、疼痛等的可行方法之一。本研究擬用前期實驗構(gòu)建的NR1-TfR單克隆表位的優(yōu)勢克隆融合蛋白表達(dá)載體pcDNA3.1-NR1/TFR（vector-S）制備NR1-TfR重組基因表位疫苗，SD大鼠口服免疫后研究該疫苗在正常大鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。方法：（1）vector-S在真核細(xì)胞HEK293內(nèi)的正確表達(dá)：vector-S轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光和western-blot分析細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物，鑒定vector-S在HEK293細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)；（2）制備NR1-TfR融合表位疫苗：vector-S經(jīng)電穿孔方法轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門桿菌（SL7207）,經(jīng)Amp抗性篩選、基因測序確定vector-S成功轉(zhuǎn)入SL7207內(nèi)，由此獲得含vector-S的細(xì)菌SL7207（命名為SL7207-S）。OD600≈0.8時運用平板菌落計數(shù)方法計數(shù)SL7207-S的細(xì)菌含量，以此制備0.5X109cfu/ml、1X109cfu/ml疫苗單位的口服疫苗；（3）NR1-TfR融合表位疫苗在SD大鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)的研究：SD大鼠按實驗要求經(jīng)灌胃法口服疫苗，兩周內(nèi)共免疫四次。在此期間觀察各組大鼠生長狀態(tài)，有無腹瀉、死亡等現(xiàn)象。取小腸組織（空腸）進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析腸道粘膜免疫反應(yīng)；以HEK293穩(wěn)定表達(dá)的vector-S蛋白作為已知抗原，細(xì)胞免疫熒光分析檢測血清和腦脊液中抗體的表達(dá)�？诜庖咭粋�月后檢測抗體在體內(nèi)持續(xù)存在的情況；結(jié)果：1）以商品化抗體NR1、OX26作為一抗，細(xì)胞免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染了vector-S的細(xì)胞HEK293可顯示紅色熒光；western-blot檢測其細(xì)胞產(chǎn)物在marker2KD-8KD范圍內(nèi)見有目的條帶；2) SL7207-S菌種質(zhì)粒S經(jīng)基因測序證實其氨基酸序列與vector-S序列一致,平板菌落計數(shù)當(dāng)OD600≈0.8時SL7207-S細(xì)菌含量為1.6X107cfu/ml;3)各組大鼠口服疫苗后生長狀態(tài)良好，未見腹瀉、死亡等現(xiàn)象；4）小腸免疫組織化學(xué)結(jié)果示空白組腸道粘膜細(xì)胞內(nèi)無棕色物質(zhì)表達(dá)，而NR1-TfR-1組（0.5X109cfu/ml）、NR1-TfR-2組(1X109cfu/ml)均有棕色物質(zhì)表達(dá)；5）細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示空白對照組大鼠血清、腦脊液作為一抗時HEK293未顯示出紅色熒光；NR1-TfR-1組、2組血清作為一抗時HEK293均顯示出紅色熒光；NR1-TfR-1組腦脊液作為一抗時HEK293無紅色熒光而NR1-TfR-2組顯示出紅色熒光，6）免疫一個月后重復(fù)檢測方法顯示NR1-TfR-2組腸道粘膜細(xì)胞內(nèi)仍有棕色物質(zhì)表達(dá)；NR1-TfR-1組血清作為一抗HEK293紅色熒光顯示較弱，而NR1-TfR-2組血清、腦脊液作為一抗HEK293紅色熒光仍明顯存在；結(jié)論：1）vector-S在真核細(xì)胞HEK293內(nèi)能正確表達(dá)其目的蛋白，符合后續(xù)動物實驗設(shè)計要求；2）成功獲得SL7207-S菌種并制備所需的兩種疫苗單位的口服疫苗；3）NR1-TfR口服疫苗在SD大鼠體內(nèi)口服安全，無明顯的細(xì)菌毒副作用；4）NR1-TfR重組疫苗成功啟動SD大鼠腸道粘膜免疫系統(tǒng)；5）兩種濃度的口服疫苗均能誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生循環(huán)抗體anti-NR1抗體，1x109cfu/ml的NR1-TfR重組疫苗產(chǎn)生的抗體可透過血腦屏障進(jìn)入腦脊液；6）anti-NR1抗體在腸道粘膜細(xì)胞、血清和腦脊液內(nèi)至少持續(xù)存在一個月以上；
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【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 潘志明;黃金林;程寧寧;崔一晨;游猛;唐麗華;張曉明;焦新安;劉秀梵;;穩(wěn)定攜帶新城疫病毒DNA疫苗減毒沙門氏菌的構(gòu)建及其免疫原性[J];病毒學(xué)報;2008年01期

2 劉麗萍;米衛(wèi)東;;葡萄糖轉(zhuǎn)運體1研究進(jìn)展[J];國際藥學(xué)研究雜志;2008年01期

3 張建瓊,張雪萍,謝維,單祥年,林陵;高效電轉(zhuǎn)化率條件的探索[J];南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版);2000年02期

4 張曉明,潘志明;運送DNA疫苗的減毒沙門氏菌載體系統(tǒng)[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2002年04期

5 陳洪,劉晶星,何平,陳淑云;口服基因疫苗質(zhì)粒穩(wěn)定性測定[J];微生物學(xué)雜志;2003年02期

6 徐鐵軍,劉志安,王玉蘭,樊紅彬,張鳳真,彭裕文;NMDA受體亞單位NR1、NR2A和NR2B mRNA在成年大鼠海馬的表達(dá)[J];徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2002年06期

7 孟繁平,丁杰,喻召才,韓全利,郭長存,劉娜,樊代明;胃癌MG7-Ag模擬表位減毒鼠傷寒沙門菌活菌疫苗研制及免疫效果[J];中華消化雜志;2005年09期

8 田士強(qiáng),王任直,李桂林,張波,姚勇,竇萬臣,孔燕國,張振興,栗世方;N-甲基-D-天冬氨酸受體NR1亞基口服基因疫苗的制備和激活SD大鼠產(chǎn)生循環(huán)抗體的初步報告[J];中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2004年04期

本文編號：1355053