本文關鍵詞：外源信號分子及腸道菌群對脆弱擬桿菌群體感應的影響　出處：《浙江大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景： 細菌之間的交流是通過分泌和感應一種被稱為自誘導劑(Autoinducer, AI)的信號分子來實現的。細菌根據這種特定信號分子濃度的變化來監(jiān)測周圍環(huán)境中其他細菌數量的變化,這種信號傳遞的過程稱為群體感應(Quorum-sensing, QS)�，F有報道的細菌QS環(huán)路有三種機制：革蘭陽性菌以修飾多肽作為信號調節(jié)分子；革蘭陰性菌主要以典型的LuxI/LuxR系統(tǒng)通過產生一類信號分子N-酰基-高絲氨酸內酯類(AHL)進行群體感應；另外一種QS分子目前認為是二類信號分子(呋喃硼酸二酯),為革蘭陰性菌和陽性菌共有。最近幾年,有關需氧菌的QS系統(tǒng)研究方興未艾,研究范圍越來越廣。但是,厭氧菌的QS系統(tǒng)類似研究至今還未見報道。 脆弱擬桿菌占人體腸道菌群的比例約為1%-2%,是引起胃腸感染的最主要的厭氧菌,多種因素導致該菌可以在腸道內大量存在并形成生物膜。脆弱擬桿菌生物膜形成是否與QS有關,該菌是否產生一類QS信號分子AHL,以及AHL與腸道菌群對該菌生物學活性的影響,目前相關研究報道極少,因此,本研究重點研究了UPLC-MS(四極桿飛行時間質譜,Q-TOF-MS)檢測AHL分子的影響因素,創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術的細菌群體感應一類信號分子AHL的檢測平臺,為系統(tǒng)研究腸道微生態(tài)細菌的信號傳導提供實驗技術和方法。另外采用分子生物學技術探討脆弱擬桿菌是否存在QS環(huán)路系統(tǒng),同時分析了與脆弱擬桿菌密切相關的其他腸道細菌及外源性AHL對脆弱擬桿菌QS相關基因表達的影響,為進一步研究其群體感應發(fā)生機制奠定基礎。 實驗一N-酰基-高絲氨酸內酯類群體感應信號分子檢測方法的建立 方法：采用UPLC/MS (Q-TOF-MS)代謝組學分析方法檢測6種N-酰基-高絲氨酸內酯標準品,重點考察UPLC-MS檢測AHL分子的各種參數,包括溶劑的選擇、流動相的優(yōu)化、濾膜孔徑、質譜的電噴霧離子化模式、色譜柱的選擇、質譜條件的優(yōu)化、AHL提取分離的前處理條件、AHL分子在質譜中的離子化特點等。 結果：創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術的細菌群體感應系統(tǒng)一類信號分子AHL的檢測平臺,其檢測參數為：正離子電噴霧離子化模式、Aquity C181.7μm2.1mm×100mm色譜柱,乙腈作為AHL溶劑及流動相。AHL內酯環(huán)結構在質譜鑒定過程中不會被破壞,在電噴霧電離四極桿飛行時間質譜中總保持m/z為102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-�；呓z氨酸內酯只見102.05特征峰),三氯甲烷甲醇水混合液作為萃取劑提取細菌培養(yǎng)液中AHL的靈敏度為5ng/ml。 實驗二基于UPLC-MS技術檢測脆弱擬桿菌群體感應一類信號分子AHL 方法：采用PCR方法擴增實驗菌株(包括脆弱擬桿菌、5種雙歧桿菌、大腸埃希菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌、傷寒沙門菌)的16SrRNA基因并測序,確保實驗菌株鑒定的準確性；在確定UPLC-MS (Q-TOF-MS)檢測AHL的各種檢測參數后,采用該方法對脆弱擬桿菌和其他多種細菌的菌液提取物中是否存在AHL進行了檢測,并以AHL標準品做對照實驗。 結果：實驗菌株16SrRNA基因序列與GenBank數據庫序列同源性大于98%,采用UPLC-MS:法檢測溶于不同細菌培養(yǎng)液中AHL標準品,其電噴霧電離四極桿飛行時間質譜均見m/z為102.05特征離子碎片或102.05和74.05特征碎片組合(N-已酰-DL-�；呓z氨酸內酯只見102.05特征峰),而脆弱擬桿菌和其他多種細菌的菌液均未檢測到AHL。 實驗三脆弱擬桿菌生物學特性的研究 方法：采用甘油厭氧肉湯及甘油普通肉湯對脆弱擬桿菌進行保存,觀察在不同時間及不同溫度保存條件下的存活狀況,同時觀察反復凍融10次對其存活力的影響。另將脆弱擬桿菌菌液分別暴露在空氣中5min、10min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、24h,觀察不同時間段脆弱擬桿菌的的生存力及生存率的變化。 結果：接種于甘油厭氧肉湯及普通肉湯中的脆弱擬桿菌在-20℃及-80℃兩種溫度下保存3個月后,反復凍融10次后均能培養(yǎng)成功,與空氣接觸180min時仍生存,24h后即死亡,與空氣接觸5min,10min,30min,60min后生存率分別為84.1%,68.1%,46.4%,34.8%。 實驗四外源信號分子及腸道菌群對脆弱擬桿菌生物學活性的影響 方法：將5種腸道常見菌的培養(yǎng)上清液及2種AHL標準品加入厭氧血培養(yǎng)液中,用于脆弱擬桿菌培養(yǎng),檢測不同培養(yǎng)時間段的脆弱擬桿菌菌液OD值,分析其在不同培養(yǎng)環(huán)境的生長曲線變化。 結果：脆弱擬桿菌在厭氧血培養(yǎng)液、含十二烷基高絲氨酸內酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌上清液、酮乙�；呓z氨酸內酯的厭氧血培養(yǎng)中培養(yǎng)時,其進入對數期的時間分別為8h、6h、6h、6h、10h、10h,其進入穩(wěn)定期時間分別為10h、8h、8h、8h、24h、24h,脆弱擬桿菌在含其他細菌上清液的厭氧血培養(yǎng)液中進入對數期及穩(wěn)定期的時間與空白厭氧血培養(yǎng)液一致。 實驗五熒光定量PCR法檢測不同培養(yǎng)環(huán)境脆弱擬桿菌群體感應相關基因的表達 方法：采用PCR方法檢測群體感應相關基因luxl及脆弱擬桿菌的luxR基因及其亞型,實時熒光定量PCR方法檢測腸道菌群及兩種AHL對脆弱擬桿菌不同亞型luxR基因的(?)RNA的相對表達量,并對其表達水平進行比較。 結果：在脆弱擬桿菌基因組中,檢測到8種luxR同源的QS類基因,只有LuxR8檢測陰性,表明這8種luxR同源基因參與該菌Ⅰ型QS環(huán)路,脆弱擬桿菌基因組中未檢測到luxl和其他lux基因。不同luxR基因亞型表達量具有一定的時間趨勢,即培養(yǎng)6小時或4小時的表達量最高,而培養(yǎng)1小時表達量相對較低,8小時后表達下降；luxRl由于表達量少,故其各時間段的表達量基本一致,而luxR8基因不存在,相應地也無mRNA表達。十二烷基高絲氨酸內酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對luxR基因表達上調,而酮乙酰基高絲氨酸內酯和屎腸球菌對luxR基因表達下調。 結論： 本課題在創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術的細菌群體感應系統(tǒng)一類信號分子AHL的檢測平臺基礎上,通過對參與脆弱擬桿菌群體感應的一類信號分子AHL和QS相關基因的篩查、不同外源性AHL及腸道菌群對脆弱擬桿菌生物學活性及l(fā)uxR基因表達影響的實驗研究,得出以下結論： 1.脆弱擬桿菌具有一類群體感應系統(tǒng),該系統(tǒng)包括LuxR調節(jié)因子參與,且LuxR調節(jié)因子具有多種亞型,LuxR調節(jié)因子可能與外源性的信號分子結合而發(fā)揮群體感應。 2.脆弱擬桿菌不存在luxⅠ基因,不產生�；呓z氨酸內酯類自誘導信號分子。 3.UPLC-MS (Q-TOF-MS)技術是檢測QS群體感應系統(tǒng)一類信號分子—高絲氨酸內酯的一種有效工具,具有準確度高、靈敏度高、精密度高、重復性好、檢測方便、線性范圍廣等特點,AHL在Q-TOF-MS中總保持m/z為102.05特征離子峰或102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-酰基高絲氨酸內酯只見102.05特征峰),該特征峰可作為AHL的質譜鑒定依據。 4.化學結構不同的高絲氨酸內酯分子及腸道常見細菌的分泌物對脆弱擬桿菌的群體感應系統(tǒng)發(fā)揮不同的效應。 5.脆弱擬桿菌在液態(tài)培養(yǎng)液中具有一定的耐氧性,并非嚴格厭氧菌,且該菌在甘油保存液中對反復凍融具有一定的抵抗力。 6.氯仿、甲醇、水混合溶劑是分離提取細菌群體感應系統(tǒng)的一類信號分子—高絲氨酸內酯的有效萃取溶劑。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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1 馬晨晨;李柏林;歐杰;王婧;趙俊虹;;高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定細菌群體感應效應的11種AHLs類信號分子[J];分析化學;2010年10期

2 陳軍輝;劉R，

本文編號：1354337