本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲性激素相關(guān)受體EsRRBL1和PGMRC2的初步研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：日本血吸蟲�。⊿chistosomiasis japonicum）是由日本血吸蟲（Schistosome japonicum）感染所引起的一種嚴(yán)重危害人畜健康的寄生蟲病。日本血吸蟲可感染人等40余種哺乳動物，但不同宿主對血吸蟲的適宜性存在較大差異。血吸蟲基因組研究表明該寄生蟲具有編碼激素的受體，并形成完整的激素通道，可以利用宿主激素促進自身的生長發(fā)育和成熟。本課題組近期研究表明，一些不同適宜性宿主來源血吸蟲蟲體中差異表達的基因或者蛋白可能對血吸蟲生長發(fā)育至關(guān)重要。本研究在不同宿主來源10d血吸蟲童蟲基因芯片研究的基礎(chǔ)上，選取了在血吸蟲抗性宿主東方田鼠來源童蟲中呈顯著低表達的兩個日本血吸蟲性激素相關(guān)新基因——雌激素相關(guān)受體β類似物1（SjEsRRBL1）和膜相關(guān)的孕酮受體組件2（SjPGMRC2），開展了以下研究。 1.宿主性別對于血吸蟲生長發(fā)育的影響 采用同一周齡、不同性別的BABL/c小鼠，在同一時間、同一條件下感染同一批釘螺逸出的尾蚴，對不同性別宿主來源的日本血吸蟲成蟲的發(fā)育情況及蟲體大小進行了兩次實驗觀察。初步結(jié)果表明，雌性小鼠中血吸蟲的發(fā)育率（56.5%和64.1%）顯著高于雄性小鼠（40.8%和47%），差異顯著(P＜0.01），同時雌鼠來源的雌、雄蟲體都比雄鼠來源的雌、雄蟲體略大一些，但差異不顯著。 2.日本血吸蟲雌激素相關(guān)受體β類似物1（EsRRBLI）的研究 利用PCR技術(shù)首次擴增獲得SjEsRRBL（1JQ612589）的全長cDNA序列，其開放閱讀框（ORF）為1374bp,編碼458個氨基酸，理論分子量是52.2kDa，理論等電點是4.71。構(gòu)建了pET32a-SjEsRRBLI重組表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌中成功表達，重組蛋白以包涵體的形式存在，分子量大小為72kDa。實時定量PCR和western blotting分析都表明SjEsRRBL1在檢測的血吸蟲童蟲和成蟲各個發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄和表達，其中在14d、18d、23d和28d的血吸蟲中轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平較35d和42d蟲體高。同時SjEsRRBL1在血吸蟲抗性宿主東方田鼠來源蟲體中表達量顯著低于易感性宿主BABL/c小鼠來源蟲體，在雌性小鼠來源蟲體中表達量要高于在雄性小鼠來源蟲體中的表達量。Western blotting分析表明重組蛋白rSjEsRRBL1具有較好的抗原性和免疫原性，rSjEsRRBL1免疫鼠血清能特異性識別血吸蟲蟲體中的天然蛋白。兩次動物保護實驗結(jié)果表明rSjEsRRBL1在BALB/c小鼠中分別誘導(dǎo)了30.84%和30.70%的減蟲率(P 0.01)及32.59%和35.61%的減卵率(P0.01)，說明該重組蛋白能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)部分免疫保護效果。ELISA實驗結(jié)果表明一免后小鼠即產(chǎn)生了抗重組蛋白SjEsRRBL1的特異性IgG抗體，并且一直維持在一個較高的水平。細胞免疫和體液免疫分析結(jié)果表明，rSjEsRRBL1結(jié)合206佐劑免疫小鼠后誘導(dǎo)了Th1/Th2混合型并以Th1型占主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本研究表明SjEsRRBL1可能在日本血吸蟲的生長發(fā)育中起著重要的作用。 3.日本血吸蟲膜相關(guān)的孕酮受體組件2（PGMRC2）的研究 利用PCR技術(shù)首次擴增獲得SjPGMRC2（FN317689.1）去除信號肽的部分cDNA序列，大小為480bp,編碼160個氨基酸，理論分子量為18162.55Da，理論等電點為6.12。構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET32a-SjPGMRC2，并在大腸桿菌中成功表達，重組蛋白可溶性表達，分子量為38kDa。實時定量PCR分析表明SjPGMRC2在檢測的血吸蟲童蟲和成蟲各個發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，在18d和23d血吸蟲中轉(zhuǎn)錄水平較高。SjPGMRC2在血吸蟲抗性宿主東方田鼠來源蟲體中表達量顯著低于易感性宿主BABL/c小鼠來源蟲體，在雌性小鼠來源蟲體中表達量要高于在雄性小鼠來源蟲體中的表達量。Western blotting分析結(jié)果表明重組蛋白rSjPGMRC2具有較好的抗原性和免疫原性。兩次動物保護實驗結(jié)果表明重組蛋白SjPGMRC2在BALB/c小鼠中分別誘導(dǎo)了22.08%和20.097%的減蟲率(P 0.01)，表明重組蛋白SjEsRRBL1能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)部分免疫保護效果。特異性抗體及淋巴細胞培養(yǎng)上清液細胞因子的測定結(jié)果表明，rSjPGMRC2結(jié)合206佐劑免疫小鼠后誘導(dǎo)了Th1/Th2混合型并以Th1型占主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。篩選獲得特異性針對SjPGMRC2的siRNA，利用該siRNA在小鼠體內(nèi)對SjPGMRC2基因進行特異性干擾，獲得24%的減蟲率。本研究表明SjPGMRC2可能對日本血吸蟲生長發(fā)育有重要作用。 本研究首次對兩個性激素相關(guān)的日本血吸蟲新基因SjEsRRBL1和SjPGMRC2進行了克隆、表達，分析了這兩個基因在不同適宜性宿主、不同性別宿主以及不同發(fā)育階段蟲體中的表達情況，評估了其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護效果，，分析了其誘導(dǎo)的免疫機制。本文為深入探討宿主性別和不同激素環(huán)境對于血吸蟲生長發(fā)育的影響提供了重要信息，為篩選日本血吸蟲新的疫苗候選分子和藥靶標(biāo)提供了重要基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1351623