本文關鍵詞：EHEC變種生物學特性分析與志賀毒素1表達調控研究　出處：《武漢工業(yè)學院》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是重要的人類食源性致病菌，人類一經(jīng)感染可引起嘔吐、腹瀉，引發(fā)出血性腸炎(Hemorrhagic enteritis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(Hemolytic-uremic syndrome，HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(Thrombotic thrombocyto-penia purpura，TTP)等綜合癥，嚴重的可導致病人死亡。以O157:H7血清型為代表的EHEC大腸桿菌致病機理復雜，stx基因、LEE毒力島上編碼緊密粘附素(intimin)的eae基因和大質粒上編碼溶血素的hly、ehxA基因等均是EHEC的重要毒力因子。在腸道內產(chǎn)生的志賀毒素Stx1、Stx2是EHEC的主要致病因素。 本實驗室在前期研究中篩選出一類少見的EHEC變種，它攜帶stx1和stx2基因但不產(chǎn)這兩種志賀毒素。目前僅日本等少數(shù)幾家實驗室發(fā)表了類似的研究報告，該類EHEC變種的志賀毒素基因表達調控機制尚不清楚。本文對該類EHEC變種的生物學特性進行分析，并對其中一株EHEC變種EC169的1型志賀毒素表達調控機制進行了初步研究。 本文采用RPLA檢驗試劑盒檢測EHEC變種EC130和EC169的志賀毒素滴度，結果表明它們均不產(chǎn)志賀毒素；PCR檢測證實這兩株EHEC變種均含有stx1、stx2、eae、hly毒力基因。PCR擴增rfbO157基因、fliCH7基因，結合血清學方法鑒定出EC169為O157:H7血清型大腸桿菌，EC130為非O157血清型大腸桿菌；RAPD分型實驗結果進一步證明EC130與其他三株O157:H7血清型的菌株親緣關系較遠。 采用終濃度為0.5μg/mL絲裂霉素C對EC130、EC169進行噬菌體的誘導，以DH5作為指示菌澆注雙層瓊脂平板，觀察到大量的噬菌斑，表明經(jīng)過絲裂霉素C誘導EHEC變種釋放了大量的噬菌體顆粒。 采用相對定量RT-real time PCR技術檢測EC169菌株stx1基因mRNA轉錄水平。用CT比較法對實時熒光定量RT-PCR結果進行分析。為消除由于模板量等造成的誤差，選用16s rRNA作為內標基因進行均一化處理，比較EC169和對照株EC1的stx1mRNA的相對表達量。結果顯示EC169菌株中stx1mRNA未見表達。證明EC169的stx1基因不能夠正常轉錄。 將對照株EC1及EC169的stx1及其上游調控基因q基因進行PCR擴增及克隆測序，，其中EC169stx1基因上游序列由hiTAIL-PCR擴增得到。對測序結果進行分析，EC1、EC169的stx1基因與日本Sakai標準株的同源性均為99%，stx1啟動子并未發(fā)現(xiàn)突變或缺失，由此可知EC169不表達志賀毒素并不是因為stx1基因本身的突變或啟動子無功能導致的。EC1的q基因與日本Sakai標準株的同源性為100%，而EC169則有6個SNP位點。 通過PCR擴增得到EC1和EC169的q基因序列，測序鑒定后分別克隆至原核表達系統(tǒng)pET-28b(+)上；CaCl2法轉化大腸桿菌BL21(DE3)，利用終濃度為1.0mmol/L的IPTG誘導Q蛋白表達，最后與EC1、EC169的全菌蛋白一起進行SDS-PAGE分析。結果顯示經(jīng)IPTG誘導后的Q蛋白表達量明顯提高，EC1、EC169的全菌蛋白在同樣的位置也有條帶，證明Q蛋白在EC1、EC169中都有表達。 實驗結果初步證明EHEC變種EC169、EC130可誘導出完整的噬菌體，釋放的Stx噬菌體仍有可能再次溶源和感染大腸桿菌，形成新的病原菌并表達志賀毒素。EC169的q基因存在突變位點，可能造成Q抗終止蛋白活性微弱，從而使下游的stx1基因不能正常轉錄和表達。本文為進一步研究攜帶stx基因不能表達志賀毒素的EHEC變種的調控機制和致病性提供了基礎。
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【學位授予單位】：武漢工業(yè)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：1350731