本文關(guān)鍵詞：EHEC變種生物學(xué)特性分析與志賀毒素1表達(dá)調(diào)控研究　出處：《武漢工業(yè)學(xué)院》2012年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是重要的人類(lèi)食源性致病菌，人類(lèi)一經(jīng)感染可引起嘔吐、腹瀉，引發(fā)出血性腸炎(Hemorrhagic enteritis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(Hemolytic-uremic syndrome，HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(Thrombotic thrombocyto-penia purpura，TTP)等綜合癥，嚴(yán)重的可導(dǎo)致病人死亡。以O(shè)157:H7血清型為代表的EHEC大腸桿菌致病機(jī)理復(fù)雜，stx基因、LEE毒力島上編碼緊密粘附素(intimin)的eae基因和大質(zhì)粒上編碼溶血素的hly、ehxA基因等均是EHEC的重要毒力因子。在腸道內(nèi)產(chǎn)生的志賀毒素Stx1、Stx2是EHEC的主要致病因素。 本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中篩選出一類(lèi)少見(jiàn)的EHEC變種，它攜帶stx1和stx2基因但不產(chǎn)這兩種志賀毒素。目前僅日本等少數(shù)幾家實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了類(lèi)似的研究報(bào)告，該類(lèi)EHEC變種的志賀毒素基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本文對(duì)該類(lèi)EHEC變種的生物學(xué)特性進(jìn)行分析，并對(duì)其中一株EHEC變種EC169的1型志賀毒素表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步研究。 本文采用RPLA檢驗(yàn)試劑盒檢測(cè)EHEC變種EC130和EC169的志賀毒素滴度，結(jié)果表明它們均不產(chǎn)志賀毒素；PCR檢測(cè)證實(shí)這兩株EHEC變種均含有stx1、stx2、eae、hly毒力基因。PCR擴(kuò)增rfbO157基因、fliCH7基因，結(jié)合血清學(xué)方法鑒定出EC169為O157:H7血清型大腸桿菌，EC130為非O157血清型大腸桿菌；RAPD分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明EC130與其他三株O157:H7血清型的菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 采用終濃度為0.5μg/mL絲裂霉素C對(duì)EC130、EC169進(jìn)行噬菌體的誘導(dǎo)，以DH5作為指示菌澆注雙層瓊脂平板，觀察到大量的噬菌斑，表明經(jīng)過(guò)絲裂霉素C誘導(dǎo)EHEC變種釋放了大量的噬菌體顆粒。 采用相對(duì)定量RT-real time PCR技術(shù)檢測(cè)EC169菌株stx1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。用CT比較法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析。為消除由于模板量等造成的誤差，選用16s rRNA作為內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行均一化處理，比較EC169和對(duì)照株EC1的stx1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示EC169菌株中stx1mRNA未見(jiàn)表達(dá)。證明EC169的stx1基因不能夠正常轉(zhuǎn)錄。 將對(duì)照株EC1及EC169的stx1及其上游調(diào)控基因q基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序，，其中EC169stx1基因上游序列由hiTAIL-PCR擴(kuò)增得到。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，EC1、EC169的stx1基因與日本Sakai標(biāo)準(zhǔn)株的同源性均為99%，stx1啟動(dòng)子并未發(fā)現(xiàn)突變或缺失，由此可知EC169不表達(dá)志賀毒素并不是因?yàn)閟tx1基因本身的突變或啟動(dòng)子無(wú)功能導(dǎo)致的。EC1的q基因與日本Sakai標(biāo)準(zhǔn)株的同源性為100%，而EC169則有6個(gè)SNP位點(diǎn)。 通過(guò)PCR擴(kuò)增得到EC1和EC169的q基因序列，測(cè)序鑒定后分別克隆至原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28b(+)上；CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，利用終濃度為1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)Q蛋白表達(dá)，最后與EC1、EC169的全菌蛋白一起進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的Q蛋白表達(dá)量明顯提高，EC1、EC169的全菌蛋白在同樣的位置也有條帶，證明Q蛋白在EC1、EC169中都有表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明EHEC變種EC169、EC130可誘導(dǎo)出完整的噬菌體，釋放的Stx噬菌體仍有可能再次溶源和感染大腸桿菌，形成新的病原菌并表達(dá)志賀毒素。EC169的q基因存在突變位點(diǎn)，可能造成Q抗終止蛋白活性微弱，從而使下游的stx1基因不能正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本文為進(jìn)一步研究攜帶stx基因不能表達(dá)志賀毒素的EHEC變種的調(diào)控機(jī)制和致病性提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢工業(yè)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1350731