本文關(guān)鍵詞：高原高寒環(huán)境因素對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用及其保護(hù)作用化合物研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景： 我國高原面積廣大，且大多處于邊境地區(qū)，戰(zhàn)略意義十分重要。高原特殊的地理環(huán)境和地貌特征造成了高原地區(qū)寒冷、低氧雙重脅迫的環(huán)境特點(diǎn)。高原環(huán)境不但損害人體健康，更影響高原部隊平戰(zhàn)時的機(jī)動性和作訓(xùn)能力，因此解決高原官兵健康問題是提高我軍戰(zhàn)斗力的必要環(huán)節(jié)。平原人初入高原時，由于氧氣濃度驟減，機(jī)體發(fā)生了一系列的病理性變化，易患高原肺水腫、高原腦水腫，而久居高原的人由于長期缺氧代償反應(yīng)，易患肺動脈高壓、高原性心臟病，而這些疾病的始動因子是內(nèi)皮細(xì)胞的紊亂。另外，在高原高寒的環(huán)境下，野外作業(yè)時間可能引起全身性低體溫（35～28℃），表現(xiàn)為外周血收縮、血液灌流減少、四肢易患凍傷，而此時最先受到損傷的仍是內(nèi)皮細(xì)胞。因此保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂成為防治高原疾病的新對策。納他卡林（natakalim，Nat）是可高選擇性的激活KATPSUR2B/Kir6.1亞型的先導(dǎo)化合物。前期研究已表明KATP的激活在高原肺水腫、高原腦水腫的防治上具有積極的作用，目前已知納他卡林可以通過逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能紊亂從而改善壓力超負(fù)荷致心力衰竭，而關(guān)于納他卡林對低氧所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與保護(hù)機(jī)制的研究還甚少。因此研究低溫、低氧及復(fù)合條件對機(jī)體的影響及其機(jī)制，并研究新型內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)藥物對抗低氧損傷的效果及其機(jī)理，具有重要的意義。 研究目的： 研究低溫（28℃）、低氧（3%O2）、低溫低氧復(fù)合三種條件下大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（rat aortic endothelial cells，RAEC）的損傷規(guī)律，用2×2析因分析的方法闡明復(fù)合損傷與單因素?fù)p傷的區(qū)別及復(fù)合條件下的主要影響因素，為進(jìn)一步認(rèn)識高原高寒環(huán)境損傷提供理論依據(jù)。另外，針對ATP敏感性鉀通道SUR2B/Kir6.1亞型選擇性開放劑——納他卡林，以急性低氧和高同型半胱氨酸（homocystein，HCY）作為損傷因素，研究藥物的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。 研究方法： 采用主動脈血管片貼壁培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)SPF級雄性Wistar大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。用MTT法測定細(xì)胞存活率、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，確定低溫?fù)p傷的有效作用時間。以21%O2、28℃培養(yǎng)30h為條件，研究低溫對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用；以3%O2、37℃培養(yǎng)30h為條件研究低氧對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用；在研究低溫低氧復(fù)合作用時，將內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對照組（21%O2、37℃）、低溫模型組（21%O2、28℃）、低氧模型組（3%O2、37℃）、復(fù)合模型組（3%O2、28℃），同時孵育內(nèi)皮細(xì)胞30h。用MTT法測定細(xì)胞存活率、硝酸還原酶法檢測一氧化氮（NO）的釋放、RT-PCR法檢測細(xì)胞間粘附因子-1（ICAM-1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、內(nèi)皮素-1（ET-1）基因的表達(dá)水平；Hoechst33258和TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；Western Blot法檢測HIF-1α蛋白表達(dá)水平；通過透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。用析因分析的方法，闡明復(fù)合損傷與單因素?fù)p傷的區(qū)別，確定復(fù)合條件下的低溫、低氧對內(nèi)皮細(xì)胞影響的主次效應(yīng)。 在研究納他卡林對低氧所致RAEC損傷的保護(hù)作用中，將細(xì)胞分為正常對照組、低氧模型組、納他卡林低、中、高劑量組，，格列本脲拮抗組。用MTT法測定細(xì)胞存活率、硝酸還原酶法檢測NO的釋放、黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定SOD活力、RT-PCR法檢測ICAM-1、VEGF、ET-1的基因表達(dá)水平；ELISA法測定ICAM-1、VEGF蛋白的表達(dá)水平。在研究納他卡林對高HCY致RAEC損傷的保護(hù)作用中，用Realtime-PCR法檢測血管細(xì)胞黏附因子（VCAM-1）、單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1）和ICAM-1基因的表達(dá)水平。 研究結(jié)果： 1.血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 采用主動脈血管片貼壁的方法，培養(yǎng)出大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，內(nèi)皮細(xì)胞陽性率98%以上。 2.寒冷對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 根據(jù)細(xì)胞存活率的測定和形態(tài)學(xué)的觀察，確定30h為低溫?fù)p傷的有效作用時間，因此將28℃孵育細(xì)胞30h作為研究低體溫?fù)p傷的體外模型。研究發(fā)現(xiàn)低溫具有明顯的降低細(xì)胞增殖率，抑制細(xì)胞NO釋放的作用，此外，低溫在細(xì)胞凋亡和通透性方面具有一定的抑制作用，而在炎性因子的釋放、內(nèi)皮素基因表達(dá)方面有一定的促進(jìn)作用，低溫時可見細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生擴(kuò)張，呈大泡狀。 3.高原低氧對內(nèi)皮細(xì)胞的影響 低氧可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制NO釋放，增強(qiáng)炎性因子和內(nèi)皮素基因表達(dá)，可導(dǎo)致血管通透性增高，HIF-1α表達(dá)量增多，低氧時細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變表現(xiàn)為線粒體腫脹、斷裂，質(zhì)膜小泡增多。 4.低溫低氧復(fù)合因素對內(nèi)皮細(xì)胞的影響 低溫低氧復(fù)合因素在細(xì)胞存活率、內(nèi)皮活性因子的釋放（NO、ET-1）、炎性因子表達(dá)、HIF-1α蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞器變化方面存在著交互作用，在通透性方面沒有交互作用。具體表現(xiàn)為：當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞長至60%后進(jìn)行干預(yù)，復(fù)合組細(xì)胞存活率與對照組、低溫組、低氧組相比均有所下降，低溫低氧對細(xì)胞存活率的影響具有正交互效應(yīng)，在復(fù)合條件下低溫為主要因素，對細(xì)胞存活率的影響更為顯著。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞長至100%后進(jìn)行干預(yù)，復(fù)合組的細(xì)胞存活率與對照組、低溫組相比有所降低，但與低氧組相比略有升高，低溫低氧對細(xì)胞存活率的影響無交互效應(yīng)，在復(fù)合條件下僅低氧對細(xì)胞存活率的具有顯著性影響。在NO釋放方面，復(fù)合組的細(xì)胞NO的釋放量與對照組、低溫組、低氧組相比均有大幅下降，低溫低氧對細(xì)胞NO的釋放量的影響具有正交互效應(yīng)，在復(fù)合條件下低溫為主要因素，對細(xì)胞NO釋放量的影響更為顯著。在細(xì)胞凋亡方面，低氧和復(fù)合條件下，均有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且復(fù)合組比低氧組凋亡細(xì)胞少；提示在復(fù)合條件下，低溫低氧具有負(fù)交互效應(yīng)，低氧為主要影響因素，低溫對細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。在炎性因子表達(dá)方面，復(fù)合組的細(xì)胞ICAM-1mRNA的表達(dá)量與對照組、低溫組相比均有所升高，但比低氧組的表達(dá)量低，低溫低氧對細(xì)胞ICAM-1基因表達(dá)的影響具有負(fù)交互效應(yīng)，在復(fù)合條件下低氧為主要因素，對細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響更為顯著。在細(xì)胞通透性方面，復(fù)合組的細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)量與對照組、低溫組相比顯著性升高，比低氧組的表達(dá)量顯著降低，低溫低氧對細(xì)胞VEGF基因表達(dá)的影響無顯著性交互效應(yīng)，在復(fù)合條件下低氧為主要因素，對細(xì)胞VEGF基因表達(dá)具有極顯著的影響。在ET-1基因表達(dá)方面，復(fù)合組的細(xì)胞ET-1mRNA的表達(dá)量與對照組、低溫組相比均有所升高，但比低氧組的表達(dá)量低，低溫低氧對細(xì)胞ET-1基因表達(dá)的影響具有負(fù)交互效應(yīng)，在復(fù)合條件下低氧為主要因素，對細(xì)胞ET-1基因表達(dá)的影響更為顯著。在低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的表達(dá)方面，復(fù)合組細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量與對照組、低溫組相比極顯著性升高，與低氧組相比略有降低，低溫低氧對細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)量的影響具有負(fù)交互效應(yīng)，在復(fù)合條件下低氧為主要因素，對細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響更為顯著。在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面，低溫低氧復(fù)合條件出現(xiàn)了線粒體發(fā)腫脹、斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等超微結(jié)構(gòu)的損傷，與單因素?fù)p傷相比具有一定的加成作用。 總之在復(fù)合損傷中，低溫在細(xì)胞增殖力和NO釋放量方面為主要影響因素，與低氧復(fù)合具有正交互作用。低氧在細(xì)胞凋亡、炎性因子的釋放、通透性改變、HIF-1α的表達(dá)方面為主要影響因素，低溫低氧復(fù)合時具有拮抗作用，即低溫具有一定的低氧損傷保護(hù)作用。 5.納他卡林對低氧致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 氧氣濃度為3%的條件下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24h，與對照組相比細(xì)胞存活率降低了22.3%，NO釋放量下降了39.9%，SOD活力降低了61.8%，ICAM-1、ET-1、VEGF基因表達(dá)量均顯著上調(diào)(P0.05, P0.01)；低氧干預(yù)12h后ICAM-1、VEGF蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05, P0.01)。0.1、1、10μmol/L納他卡林與內(nèi)皮細(xì)胞孵育8h，在氧氣濃度為3%的條件下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24h后，與模型組相比，納他卡林三個劑量組均可逆轉(zhuǎn)低氧所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變，包括提高內(nèi)皮細(xì)胞生存活力和NO的釋放水平、增強(qiáng)SOD活力、顯著抑制低氧所致ICAM-1、ET-1、VEGF基因過度表達(dá)(P0.05, P0.01)及ICAM-1、VEGF蛋白的高表達(dá)（P0.05, P0.01）。使用格列本脲作為拮抗劑預(yù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞6h，再用10μmol/L納他卡林孵育8h后，置于氧濃度為3%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在細(xì)胞存活率、NO的釋放和SOD活性方面，格列本脲可顯著逆轉(zhuǎn)納他卡林的保護(hù)作用（P0.01）。 6.納他卡林對高同型半胱氨酸致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 0.1mmol/L同型半胱氨酸孵育大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞6h，與正常對照組相比， VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)。0.001,0.01,0.1,1,10μmol/L納他卡林與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育8h，再給予0.1mmol/LHCY孵育6h后，與模型組相比，0.001～10μmol/L納他卡林均可顯著抑制高同型半胱氨酸所致VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因過度表達(dá)，但未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)，0.001μmol/L納他卡林即可對高同型半胱氨酸致內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的過度表達(dá)起到抑制作用，說明納他卡林具有強(qiáng)效的內(nèi)皮保護(hù)效果。 結(jié)論： 低溫低氧復(fù)合損傷與單因素?fù)p傷不同，在細(xì)胞增殖、NO釋放、炎癥因子表達(dá)、內(nèi)皮素基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、HIF-1α蛋白表達(dá)方面具有交互效應(yīng)，在VEGF基因方面無交互作用。低溫低氧復(fù)合在抑制細(xì)胞增殖、抑制NO的釋放方面具有正交互效應(yīng)，而在炎性因子表達(dá)、ET-1基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、HIF-1α蛋白表達(dá)方面，具有負(fù)交互效應(yīng)，即低溫對低氧損傷起到了一定的保護(hù)作用。以KATP為靶點(diǎn)的先導(dǎo)化合物納他卡林可逆轉(zhuǎn)低氧及高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，具有強(qiáng)效的內(nèi)皮保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 李鳳芝，顏培華，劉友梅，張是敬;低溫對培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的研究①[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;1994年02期

2 顏培華,李鳳芝;大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定方法[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;1993年02期

3 蔡文琴,姚忠祥;無神經(jīng)支配血管的內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控機(jī)制[J];生命科學(xué);1999年01期

4 汪海,龍超良,賈國棟,何華美,解衛(wèi)平,馮華松,胡剛,劉國樹;鹽酸埃他卡林對內(nèi)皮素系統(tǒng)的影響[J];中國藥理學(xué)通報;2005年01期

5 段智變;汪海;;血管內(nèi)皮細(xì)胞活性化合物對同型半胱氨酸致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J];中國藥理學(xué)通報;2006年05期

6 唐淵;王汝歡;潘志遠(yuǎn);崔文玉;汪海;;ATP敏感性鉀通道SUR2B/Kir6.1亞型選擇性開放劑納他卡林的心血管藥理學(xué)作用特征[J];中國藥理學(xué)通報;2009年02期

7 劉蔚,肖文彬,汪海;格列本脲對抗高血壓新藥鹽酸埃他卡林心血管作用的影響[J];高血壓雜志;2003年04期

8 楊曦明,謝印芝,聶鴻靖,尹昭云;低氧大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGF變化與PKC活性關(guān)系的探討[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2000年03期

9 南新中,洪欣,劉忠文,謝印芝,孫興斌,尹昭云;低氧時豬肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET－1和EDNO的變化及乙酰膽堿的影響[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;1996年03期

本文編號：1350144