本文關(guān)鍵詞：永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞株的建立及向胰島素分泌細(xì)胞分化　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：糖尿病是繼心血管疾病和癌癥之后的第三大高發(fā)慢性疾病,它還會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生,如眼疾、腎臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病及糖尿病高滲綜合癥等。豬胰島因組織來(lái)源豐富,胰島素結(jié)構(gòu)與人相似,且能在人體血清內(nèi)存活發(fā)揮特定的生理性血糖調(diào)節(jié)作用,可以作為新的可替代的供體細(xì)胞來(lái)源。但是胰腺內(nèi)胰腺干細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少,而且該細(xì)胞長(zhǎng)期處于生長(zhǎng)阻滯期,這樣胰腺干細(xì)胞的增殖能力受到了極大的限制。本研究旨在通過(guò)酶消化胎豬胰腺組織分離出胰島樣細(xì)胞團(tuán),單克隆擴(kuò)增出間充質(zhì)干 細(xì)胞,進(jìn)一步轉(zhuǎn)染人的端粒酶基因獲得永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞株,對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行生物學(xué)特性檢測(cè),判斷其是否具有胰腺干細(xì)胞的相關(guān)特性,能否用于糖尿病胰島β細(xì)胞受損的替代治療。 1.永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性 本研究采用先懸浮后貼壁的方法從2.5~3月齡胎豬胰腺組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染hTERT,單克隆出永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)質(zhì)干細(xì)胞株,體外多次傳代后仍然保持很強(qiáng)的增殖活力(100代以上),通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制、流式細(xì)胞儀分析表面抗原、免疫熒光/組化染色、RT-PCR檢測(cè)、成瘤性檢測(cè)以及體外可定向誘導(dǎo)分化等方法,對(duì)該細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定,證明其具有經(jīng)典間充質(zhì)干細(xì)胞和部分胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性,并具有定向分化為類神經(jīng)、心肌和生殖細(xì)胞的潛力,將其移植入裸鼠體內(nèi)未觀察到成瘤現(xiàn)象。 2.永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞定向分化 建立了一個(gè)體外兩步法向胰島素分泌細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)分化方案,第一步:添加10 mmol/L尼克酰胺、100 ng/mL ActivinA、20 ng/L EGF和20 ng/L bFGF的方法先貼壁誘導(dǎo)4 d,隨后將其移至低粘附性培養(yǎng)皿中繼續(xù)誘導(dǎo)3 d;第二步:撤去EGF和bFGF,添加10 nmol/L Exendin4和4 nmol/Lβ-細(xì)胞素(BTC),繼續(xù)懸浮誘導(dǎo)1 w,將永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成胰島樣細(xì)胞團(tuán)。誘導(dǎo)后的細(xì)胞團(tuán)呈DTZ、PDX1、Insulin、C-peptide陽(yáng)性。高低糖刺激后,誘導(dǎo)的細(xì)胞具有良好的葡萄糖反應(yīng)性,能夠分泌胰島素和C-肽。通過(guò)注射STZ的方法,建立小鼠糖尿病模型,將誘導(dǎo)后的細(xì)胞移植入糖尿病模型小鼠體內(nèi)后,可2 w內(nèi)緩解糖尿病模型小鼠的高血糖狀況。將永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞移植入小鼠睪丸,切片染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞可以在體內(nèi)自發(fā)分化為生殖細(xì)胞和在高糖狀況下自發(fā)分化為胰島素分泌細(xì)胞。 3. GSK3抑制劑-BIO調(diào)控永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖 體外添加BIO后,通過(guò)免疫熒光染色、QRT-PCR檢測(cè)、Western-blotting、熒光素酶活性分析、BrdU增殖分析及細(xì)胞凋亡(Tunel染色分析),初步認(rèn)為永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)其增殖,但通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)和葡萄糖刺激反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)證實(shí)BIO在該細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的過(guò)程中無(wú)顯著效用,因而認(rèn)為BIO能夠促進(jìn)永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖并保持其未分化的狀態(tài)。 上述結(jié)果表明,永生化胎豬胰腺源間充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的體外增殖能力,體外能夠向其他類型細(xì)胞進(jìn)行分化,可以為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究提供足夠的細(xì)胞資源。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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