本文關鍵詞：日本血吸蟲酚氧化酶基因結構及其功能的研究　出處：《武漢大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景：血吸蟲病(schistosomiasis)給公共衛(wèi)生及農(nóng)牧業(yè)造成了極大的危害。日本血吸蟲(Schistosoma japonicum, S. japonicum)每條雌蟲平均每天產(chǎn)卵約2,200個,大多數(shù)蟲卵沉積在宿主的肝臟和結腸腸壁等組織中,成熟蟲卵中的毛蚴釋放可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen, SEA)引發(fā)宿主的免疫病理反應,從而形成蟲卵肉芽腫(egg granuloma)及導致組織纖維化,部分蟲卵隨宿主糞便排出體外,入水后可孵育出毛蚴感染中間宿主釘螺,成為血吸蟲病傳播的起始。因此,蟲卵在血吸蟲的致病及傳播中起了重要的作用。從理論上講,抑制血吸蟲雌蟲產(chǎn)卵或阻止蟲卵成熟將有助于防控血吸蟲病。目前尚無有效的血吸蟲疫苗,防治血吸蟲病主要依賴化學藥物吡喹酮,但藥物本身有一定的副作用,并且長期使用有可能產(chǎn)生耐藥性,研究新的血吸蟲病防制手段極為迫切。酚氧化酶(phenol oxidase,PO)在日本血吸蟲蟲卵卵殼形成過程中起著非常重要的作用。PO是一種銅離子結合的氧化酶,能催化兩個不同的酶學反應：1)單酚氧化酶(MPO, monophenol oxidase, E.C.1.14.18.1)將單羥基酚(monophenol)氧化為雙羥基酚(diphenol);2)雙酚氧化酶(DPO, diphenol oxidase, E.C.1.10.3.1)將雙羥基酚再進一步氧化為醌(quinones)。血吸蟲的基因編碼兩種形式的PO。Ftitzpatrick等(2007)報道了曼氏血吸蟲兩個PO的分子特性；蔡國斌等(2009)報道了日本血吸蟲兩個PO (SjPO1和SjP02)的分子特征和表達。但SjPO1和SjPO2的基因組結構之前未見報道,而且尚不清楚是否還存在其它形式的PO,以及是否SjPO1和SjPO2均在日本血吸蟲蟲卵卵殼的形成過程中起作用。 目的：本課題的開展基于如下假設：由于SjPO1和SjPO2的mRNA序列已經(jīng)公布,并且二者的同源性較高(有38%的氨基酸序列相同),因此推測它們具有相同的功能,都參與日本血吸蟲蟲卵卵殼的硬化過程。有必要深入了解SjPO1和SjPO2的分子特性、在日本血吸蟲不同發(fā)育階段的表達及組織定位,以及能否誘導抗血吸蟲生殖,并在基因水平揭示SjPO的功能,尤其在蟲卵卵殼硬化過程中的作用機制。 方法：根據(jù)SjPO1和SjPO2的mRMA序列,用PCR擴增SjPO1和SjPO2的基因組序列、測序并進行結構分析；用半定量RT-PCR檢測這兩個基因在日本血吸蟲的不同發(fā)育階段的轉錄水平；用免疫組化和原位雜交技術對SjPO1和SjPO2在日本血吸蟲成蟲及肝臟內蟲卵中的分布進行定位；制備SjPO1重組蛋白并免疫小鼠觀察能否誘導小鼠的減蟲或減卵作用；用小干擾RNA (siRNA)介導SjPO1和SjPO2基因的敲減,比較敲減其中一個與同時敲減兩個基因的干擾效果；用重組慢病毒載體(lentiviral vector, LV vector)轉導外源基因到日本血吸蟲體內,產(chǎn)生siRNA干擾SjPO1基因的表達,檢測其對PO活性的抑制效果；通過評估基因轉錄水平和酶蛋白水平的改變比較這兩種干擾方法的沉默效率。 結果：SjPO1和SjPO2在系統(tǒng)進化上可能源自共同的祖先基因,它們的基因組結構均由3個外顯子和2個內含子組成；SjPO1和SjPO2在尾蚴階段均未見有轉錄,隨著在終宿主體內的發(fā)育其轉錄水平逐漸增加,它們在雌性成蟲的轉錄水平高于雄性成蟲的,SjPO1基因的表達水平高于SjPO2基因的；SjPO1和SjPO2基因均在雌性成蟲的卵黃腺、雄性成蟲的體表及蟲卵內的毛蚴有表達；SjPO1重組蛋白免疫小鼠不能誘導減蟲作用,但有一定的減卵作用,減卵率為21.67%；敲減SjPO1和SjPO2基因的表達后PO的活性均有顯著下降,并且蟲卵卵殼的形態(tài)出現(xiàn)異常改變,包括梭形卵、卵殼凹陷以及相互粘連,當DPO活性下降約超過45%時,卵殼的自發(fā)熒光明顯減弱,而同時雌蟲子宮內出現(xiàn)熒光；同時敲減兩個SjPO基因的抑制效果較敲減一個的明顯；慢病毒載體介導的干擾效果優(yōu)于siRNA所介導的。 結論：SjPO1和SjPO2均在日本血吸蟲蟲卵卵殼硬化的過程中起重要作用,但以SjPO1為主。研究結果從基因水平進一步揭示了SjPO的功能,也為抗血吸蟲雌蟲生殖的深入研究提供了理論參考。
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【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R383.24

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本文編號：1348719