本文關(guān)鍵詞：磷硫�；疍NA在細(xì)菌中作為抗氧化劑的機(jī)制研究　出處：《上海交通大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：在細(xì)菌的DNA上進(jìn)行磷硫酰化修飾（硫修飾），而硫修飾DNA在電泳過程中發(fā)生降解表型(DNA degradation，Dnd)。負(fù)責(zé)這種磷硫�；揎椆δ艿牡鞍子�5個(gè)連鎖并存在于一個(gè)基因組島上的5個(gè)基因dndA-E編碼，其中四個(gè)基因dndA和dndC-E是磷硫�；揎椝匦璧幕�。而對(duì)于生理學(xué)意義直到最近，才在天藍(lán)色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了特異地限制磷硫�；疍NA的基因，在沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)了磷硫�；揎椣拗葡到y(tǒng)。到目前為止磷硫�；揎桪NA電泳過程中降解機(jī)制不明，且其生理學(xué)意義知之甚少。 用化學(xué)合成的模擬底物磷硫�；揎椀亩塑誨G~SA和PAA-TAE激活液反應(yīng)，作為研究磷硫酰化DNA電泳過程中降解機(jī)制的模擬反應(yīng)，產(chǎn)物在HPLC圖譜上顯示6個(gè)新的UV_(254nm)吸收峰。PAA-TAE激活液的化學(xué)組成包括了過氧化氫、過氧乙酸、乙酸、Tris堿和乙二胺四乙酸（EDTA）。將各個(gè)組分解離開來分析，其中PAA能夠直接將去離子水中的dG~SA氧化切割生成6個(gè)產(chǎn)物（化合物2-7），，不需要Tris等一級(jí)胺的參與。在不同pH的Tris溶液中用PAA氧化切割dG~SA，得到各個(gè)氧化切割產(chǎn)物的比例是不一樣的。在1%乙酸溶液中用PAA處理dG~SA，可以得到高比例的過渡態(tài)氫膦酸酯化的二核苷dG~HA（化合物2），這為后續(xù)很多實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 通過高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)分析得到各個(gè)化合物的精確分子量和可能的化學(xué)分子式，再根據(jù)各個(gè)化合物斷裂后形成的離子碎片與原結(jié)構(gòu)的比較，初步推測(cè)了化合物2-7的可能結(jié)構(gòu)。根據(jù)推測(cè)的結(jié)構(gòu)，利用化學(xué)合成的標(biāo)準(zhǔn)品與各個(gè)化合物的HPLC保留時(shí)間、紫外吸收特征、質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜等特性的比較，最終確定了各個(gè)氧化切割產(chǎn)物的具體結(jié)構(gòu)。化合物2是腺嘌呤鳥嘌呤脫氧核糖核苷二核苷的氫膦酸二酯dG~HA，化合物3是正常的二核苷酸dG~OA，化合物4是帶有鳥嘌呤脫氧核糖核苷的氫膦酸單酯，化合物5是腺嘌呤脫氧核糖核苷，化合物6是鳥嘌呤脫氧核糖核苷，化合物7是帶有腺嘌呤脫氧核糖核苷的氫膦酸單酯。 通過在酸性環(huán)境下制得高比例的過渡態(tài)化合物2，然后將反應(yīng)液冷凍干燥，再溶解在不同pH溶液中進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)，在pH5.0的條件下氫膦酸二核苷dG~HA發(fā)生水解斷裂，最終提出了磷硫�；疍NA被PAA通過先氧化再水解的兩步降解機(jī)制。用磷硫酰化二乙酯作為底物和PAA或者過氧化氫反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)冷凍干燥后發(fā)現(xiàn)有刺激氣味的黃色物質(zhì)產(chǎn)生，用GC-MS確定了該物質(zhì)是單質(zhì)硫。在酸性條件下制得了高比例的氫膦酸酯化的二核苷dG~HA，然后用Tris堿迅速調(diào)節(jié)pH到7.0，發(fā)現(xiàn)有大量的氫膦酸酯化的二核苷轉(zhuǎn)化到正常的二核苷。而磷硫�；幕蚪MDNA也具有類似的現(xiàn)象，當(dāng)PAA處理后的樣品迅速調(diào)pH之后DNA降解現(xiàn)象急劇減弱甚至消失。過氧化氫也能夠和磷硫�；疍NA直接發(fā)生反應(yīng)，并將磷硫酰化DNA氧化到正常狀態(tài)的磷酸酯DNA或使其氧化損傷斷裂。 最終提出磷硫�；疍NA在電泳過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)即降解機(jī)制，磷硫�；疍NA的最終命運(yùn)有兩種可能性，一種是磷硫�；疍NA可以在PAA等氧化劑的作用直接氧化到正常的DNA，或者先被氧化到氫膦酸酯然后再被氧化到正常的DNA而不會(huì)引起磷硫�；疍NA斷裂降解；另一種是磷硫酰化DNA被PAA氧化到氫膦酸酯的DNA，然后被水解而表現(xiàn)為磷硫�；疍NA電泳過程中的降解。 當(dāng)用不同濃度的磷硫�；塑誨G~SA與過氧化氫反應(yīng)，HPLC檢測(cè)反應(yīng)后剩余的過氧化氫量，磷硫�；痙G~SA量的增加可明顯地消耗更多的過氧化氫，而正常的磷酸酯化的二核苷dG~OA則不能夠消耗過氧化氫，證明磷硫�；疍NA能夠作為還原劑消耗過氧化氫。用不同濃度的過氧化氫或過氧乙酸與磷硫酰化DNA反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在0.14mM PAA作用下就有正常的二核苷dG~OA生成，而利用MS的高精度特性可以在10μM PAA存在下檢測(cè)到dG~OA生成。暗示生理氧化壓力條件下，磷硫�；腄NA可以作為抗氧化劑消耗過氧化氫而減小氧化壓力對(duì)生物體的影響。過氧化氫處理含有和缺失磷硫�；疍NA的沙門氏菌株，生長(zhǎng)曲線顯示含有磷硫�；揎桪NA的野生型、dptＢ缺失突變株能夠在較高濃度的過氧化氫環(huán)境下生長(zhǎng)，而缺失了磷硫�；揎桪NA的dptＣ、Ｄ、Ｅ突變菌株則不能夠在較高濃度的過氧化氫環(huán)境下生長(zhǎng)。這就證明磷硫酰化修飾的DNA賦予了微生物抵抗一定量的過氧化氫的能力。 用不同濃度的過氧化氫處理含有或缺失磷硫�；疍NA的沙門氏菌株，提取總基因組DNA電泳檢測(cè)，磷硫�；疍NA的菌株在一定濃度的過氧化氫處理后其DNA保存的比較完整，但缺失磷硫�；疍NA的菌株其DNA發(fā)生了明顯的雙鏈斷裂現(xiàn)象。表明磷硫酰化DNA在體內(nèi)要比非磷硫�；疍NA更加耐受氧化壓力造成的氧化損傷。用Dnd現(xiàn)象檢測(cè)DNA磷硫酰化修飾豐度變化表明，磷硫�；揎椮S度在一定濃度的過氧化氫處理后明顯地降低。但同時(shí)在一定濃度條件下檢測(cè)不到明顯的變化，可能是因?yàn)榛钚匝醴肿訉⒘琢蝓；疍NA轉(zhuǎn)化為正常的磷酸酯化DNA，然后在宿主dpt相關(guān)基因編碼蛋白的作用下重新進(jìn)行了磷硫酰化修飾。 自然界的沙門氏菌含有磷硫�；揎桪NA，能夠作為抗氧化劑抵抗一定的氧化壓力。當(dāng)將編碼沙門氏菌的整個(gè)dpt基因簇質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中，賦予新宿主菌以磷硫酰化修飾DNA的特性，增加了宿主菌對(duì)抗過氧化氫的能力。證明磷硫酰化DNA可以給細(xì)菌帶來抗氧化壓力的能力，也可以解釋為什么編碼磷硫�；揎桪NA的基因處于一個(gè)基因組島上，使其能夠在微生物間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移然后賦予新宿主以抵抗氧化壓力的能力。 綜上所述，磷硫�；疍NA在電泳過程中降解主要是因?yàn)楸贿^氧化物氧化生成氫膦酸酯化DNA，然后發(fā)生水解而斷裂；磷硫酰化DNA能夠作為抗氧化劑保護(hù)DNA免受氧化損傷，并消除一部分的氧化壓力，從而提高宿主菌在氧化壓力下的生存能力。
[Abstract]:Phosphorothioylation modification (sulfur modified) on the DNA of bacteria, while sulfur modified DNA has a degradation phenotype (DNA degradation, Dnd) during the electrophoresis. The protein responsible for this phosphorylation and thiylation modification is encoded by 5 dndA-E genes linked to 5 genes on a genomic island, of which four genes dndA and dndC-E are necessary genes for phospho thioylation. For physiological significance, until recently, a gene that specifically phosphorylated DNA was found in Streptomyces sky blue, and a phosphorylthioylation modification system was found in Salmonella. So far, the mechanism of degradation of phosphonothioylated DNA electrophoresis is unknown, and its physiological significance is very little.
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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