本文關(guān)鍵詞：C3d分子佐劑核酸疫苗的構(gòu)建與免疫效果研究　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：近年來,隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展,運用基因重組表達技術(shù)研制預(yù)防、治療用生物制品己經(jīng)成為免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點,其中核酸(DNA)疫苗倍受青睞。該疫苗是繼滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同時激發(fā)機體體液和細胞免疫應(yīng)答、使用安全、易于生產(chǎn)等優(yōu)點,并可將多種基因聯(lián)合在一起制成基因聯(lián)合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表達量低,激發(fā)的免疫應(yīng)答較弱,從而限制了其開發(fā)應(yīng)用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成為基因免疫研究中急需解決的問題;目前常采用新型分子佐劑,如白細胞介素、干擾素、胸腺肽和補體分子佐劑等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中補體C3d分子佐劑倍受人們的關(guān)注。 補體C3d分子是補體C3被抗原激活以后的最終裂解片段,能夠促進抗原提呈細胞對抗原的攝取、提呈作用,增強機體的免疫應(yīng)答能力。因此,C3d已經(jīng)成為核酸疫苗有效的新型分子佐劑。但是C3d作為分子佐劑具有種屬差異性,不同種動物間C3d免疫增強作用的差異性需要作進一步的研究。 PRRSV GP5基因編碼的GP5蛋白為糖基化囊膜蛋白,該蛋白具有較好的免疫原性,能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫。invH基因是沙門氏菌A-E群的高度保守基因,編碼吸附和侵襲上皮細胞表面的蛋白,該蛋白決定沙門菌對腸粘膜細胞的侵襲力。 本研究首先對哺乳動物豬、鼠的C3d基因進行克隆及序列測定分析,并探討了不同種動物(豬、鼠、雞、鴨)間補體C3d在基因水平上的相關(guān)性和差異性,然后以PRRSV GP5為模型基因,利用鼠、豬(哺乳動物)C3d的受體結(jié)合功能區(qū)p28和雞、鴨(禽類動物)C3d的受體結(jié)合功能區(qū)p29作為分子佐劑,構(gòu)建了C3d-p28(29).n(n=2、4、6)多聚體分子佐劑PRRSV GP5核酸疫苗和沙門氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用構(gòu)建的核酸疫苗免疫小鼠并對其免疫效果進行了體液和細胞免疫主要指標(biāo)的檢測,探討不同動物C3d-p28(29)對核酸疫苗的免疫增強作用。本研究主要包括四部分內(nèi)容: 1、哺乳動物豬、鼠補體C3d基因的克隆及序列分析:為了獲得哺乳動物(豬、鼠)的補體C3d基因克隆并比較同禽類動物(雞、鴨)C3d基因序列的差異性,首先從哺乳動物鼠、豬的肝組織中提取總RNA,通過RT-PCR擴增C3d基因的cDNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定后直接克隆到pMD18-T載體,構(gòu)建pMD18-T-C3d重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,酶切鑒定并進行序列測定,然后進行C3d序列和CR2結(jié)合區(qū)同源性比較分析。電泳結(jié)果顯示,分別在936bp和888bp處呈現(xiàn)明亮的條帶,成功獲得了鼠和豬的C3d基因克隆。序列分析結(jié)果表明,哺乳動物(豬、鼠)和禽類(雞、鴨)的補體C3d基因同源性僅為64%;進化樹顯示,哺乳動物與禽類的親緣關(guān)系越近,C3d基因進化關(guān)系也越近。哺乳動物(豬、鼠)與禽類(雞、鴨)C3d基因的CR2結(jié)合區(qū)比較分析發(fā)現(xiàn),禽類為29個氨基酸,而哺乳動物為28個氨基酸,兩類動物該區(qū)氨基酸的同源性僅為62%,而鼠、豬兩種哺乳動物之間、雞、鴨兩種禽類動物之間的同源性分別達82.8%和84%,證明補體C3d及CR2結(jié)合區(qū)具有種屬的差異性。 2、不同動物C3d分子佐劑PRRSV GP5核酸疫苗的構(gòu)建:為探明不同動物C3d分子佐劑在核酸疫苗中的免疫增強作用,在上述試驗克隆了動物C3d cDNA的基礎(chǔ)上,設(shè)計引物克隆C3d-p28(29)至pUC19載體,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ構(gòu)建多聚體C3d-p28(29).n,將其克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)上;然后以RT-PCR擴增的PRRSV GP5基因作為模式基因,定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1-C3d-p28(29).n中p28(29).n上游,構(gòu)建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 (29).n重組質(zhì)粒。酶切結(jié)果顯示,電泳后在807、987、1167bp處分別出現(xiàn)了明亮的條帶,表明成功構(gòu)建了含有補體C3d-p28(29)多聚體分子佐劑的PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n)。 3、不同動物C3d分子佐劑對PRRSV GP5核酸疫苗免疫增強效果研究:為了探索不同動物C3d分子佐劑對PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增強作用及差異性,在構(gòu)建了鼠、豬、雞、鴨四種動物補體C3d-p28(29).n PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).2.4.6)及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基礎(chǔ)上,分別提取質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至Marc145細胞進行瞬時表達,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA試劑盒分別檢測各免疫組小鼠的GP5抗體水平和IL-4、IFN-γ含量。結(jié)果表明,以補體C3d-p28(29).n為分子佐劑的PRRSV GP5基因重組疫苗均可在Marc145細胞內(nèi)進行表達;連接不同動物C3d-p28(29)2,4,6聚體的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗體水平、IL-4和IFN-γ含量均比空載體(pcDNA3.1)和pcDNA3.1-GP5對照組的升高,差異均顯著(P0.05),其中以pcDNA3.1-GP5-p28(29).6組的效果最佳,但均不如PRRSV油乳劑滅活苗組的效果好。另外,含有C3d-p28(29).n(n=2,4,6)相同聚體的疫苗免疫組小鼠血清中的GP5抗體水平、IL-4和IFN-γ含量兩兩比較無差異性。 4、鼠C3d分子佐劑沙門氏菌invH基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究:為了進一步探討分子佐劑C3d在細菌核酸疫苗中的免疫增強作用,以沙門氏菌invH為核酸疫苗的模式基因,構(gòu)建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重組質(zhì)粒,免疫BALB/c小鼠并檢測了小鼠血清中invH抗體和IL-4、IFN-γ的含量,然后進行小鼠攻毒保護試驗。結(jié)果表明,小鼠血清中invH抗體水平、IL-4和IFN-γ的含量與pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH對照組比較,差異均顯著(P0.05)。通過攻毒試驗結(jié)果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗對小鼠的免疫保護率高于pcDNA3.1-invH組,差異顯著(P0.05),與空白組和pcDNA3.1組比較,差異均極顯著(P0.01),但核酸疫苗的保護效果不及滅活疫苗。 本研究結(jié)果探明了動物C3d分子佐劑對病毒及細菌核酸疫苗的免疫增強作用,為開發(fā)利用不同動物C3d分子佐劑研制其他病原的核酸疫苗提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。
[Abstract]:In recent years, with the development of molecular biology, immunology theory and technology, the use of gene recombination technology to develop biological products for prevention and treatment has become a hot research topic in immunology. Nucleic acid (DNA) vaccine is very popular. The vaccine is a new generation of vaccines following inactivated vaccine, live attenuated vaccine, subunit vaccine and genetic engineering vaccine. Nucleic acid vaccine has the advantages of simultaneous stimulation of body fluid and cellular immune response, safety and ease of production. It can combine multiple genes to make gene combined vaccine. However, due to low expression of DNA vaccine protein and weak immune response, the speed of its development and application is limited. Therefore, to enhance the immune effect of DNA vaccine has become an urgent problem in the study of gene immunization; currently used new molecular adjuvant, such as interleukin and interferon, thymosin and complement molecular adjuvant is an important measure to improve the immune effect of DNA vaccine, which complement C3d molecular adjuvant attention.
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1342164