本文關(guān)鍵詞：A族鏈球菌多價表位疫苗的制備及所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:A群鏈球菌(Group A streptococcus,GAS)是臨床上最常見的致病性革蘭陽性菌之一,可引起化膿性感染、中毒性疾病和多種自身免疫性疾病。在我國5個省市進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),8 ~ 13歲學(xué)齡兒童A群鏈球菌感染率可高達(dá)50%,在部分農(nóng)村地區(qū)甚至達(dá)到70% ~ 80%[1]。在所有GAS引起的疾病中,以GAS上呼吸道感染后導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)性疾病急性腎小球腎炎和風(fēng)濕熱的危害最為嚴(yán)重。由于GAS血清型眾多且某些免疫原性強(qiáng)的表面蛋白可能與人的蛋白存在交叉反應(yīng),目前還沒有理想的疫苗問世[2]。 20多年來,多數(shù)疫苗研究集中于GAS的M蛋白,雖說它的免疫原性及免疫保護(hù)性都很好,但因其血清型眾多及其可能誘導(dǎo)有害的自身免疫反應(yīng),阻礙了以它為基礎(chǔ)的疫苗的應(yīng)用,近期人們已把目光投向其他GAS表面蛋白。Fba蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于GAS表面的蛋白,Terao Y.通過Southern雜交發(fā)現(xiàn)其至少存在于GAS的18個血清型中[3]。本室前期研究發(fā)現(xiàn)Fba蛋白具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)作用[4,5],因此,Fba蛋白有望成為GAS的候選疫苗。 本室前期工作中用獲得的抗GAS單克隆抗體A8鑒定出Fba作為免疫原的優(yōu)勢氨基酸序列Fba96-118,同時用抗GAS多克隆抗體篩選出了Fba蛋白的15個線性表位。根據(jù)此本研究設(shè)計了2個由表位串聯(lián)的肽段,一為已篩選出的Fba蛋白8個優(yōu)勢表位構(gòu)成的肽段,簡稱P5,另一為P5和M蛋白無交叉反應(yīng)型特異性序列相連的重組多肽段P5+Mb。通過PCR獲得這兩個重組多肽段的核苷酸序列并克隆至載體表達(dá)。將克隆表達(dá)的肽段免疫動物并攻毒,以確定其保護(hù)率。并利用流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR、ELISA、HE染色等實驗技術(shù)檢測了表位肽段誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫的狀況。 方法: 1利用生物信息學(xué)方法從噬菌體肽庫篩選獲得的Fba蛋白的線性表位中篩選出8段優(yōu)勢氨基酸序列,采用搭橋PCR方法串聯(lián)擴(kuò)增該基因片段P5并克隆表達(dá)。 2通過基因序列比對人體組織基因庫獲得A族鏈球菌1、3、6、18四個血清型M蛋白型特異性序列,采用搭橋PCR方法串聯(lián)擴(kuò)增該基因片段即Mb。 3連接P5與Mb基因片段并克隆表達(dá)。同時構(gòu)建Fba全長蛋白基因片段并克隆表達(dá)全長蛋白為對照。Western blot鑒定融合蛋白P5+Mb、P5和Fba蛋白。 4三段蛋白大量表達(dá)純化后以相同劑量免疫小鼠,設(shè)立PBS對照組。每組8只;每次免疫間隔10天,并在下次免疫前內(nèi)眥取血,共免疫4次,末次免疫后10天攻毒或處死動物。 5末次免疫后10天,每組一半動物處死,流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟CD4+、CD8+細(xì)胞的變化。Real-time PCR方法檢測小鼠脾臟細(xì)胞IL-4、IL-12、IFN-γ細(xì)胞因子mRNA表達(dá)。ELISA檢測各實驗組血清IgG水平的動態(tài)變化。 6用致死量GAS(M+Fba+)攻擊免疫后的另一半小鼠,計算各組的保護(hù)率。 7各實驗組小鼠處死后觀察其心、腎組織的大體形態(tài)變化,HE染色了解疫苗誘導(dǎo)的免疫是否能與小鼠組織發(fā)生交叉反應(yīng)而引起病理改變。同時用GAS感染與實驗組同周齡的小鼠,5天后與實驗組小鼠一同處死作對照。 結(jié)果: 1成功構(gòu)建了PET28a-P5+Mb、PET28a-P5和PET28a-Fba的原核表達(dá)質(zhì)粒,并分別得以表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,P5+Mb、P5和Fba蛋白與單克隆抗體A8有明顯的雜交。 2流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示P5+Mb組的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平都顯著高于PBS組(P0.05)。而P5組和Fba組與PBS對照組無顯著差異。 3 Real-time PCR結(jié)果顯示IL-4細(xì)胞因子水平P5+Mb組顯著高于其他組(P0.05),其他各組之間無差異。IL-12細(xì)胞因子水平Fba組著高于PBS組(P0.05),其他各組與對照組無差異。IFN-γ細(xì)胞因子水平P5+Mb組及Fba組均著高于PBS組(P0.05)。 4 ELISA結(jié)果顯示免疫后小鼠IgG水平逐漸增高,P5+Mb組效價可達(dá)到1:407680,P5組效價可達(dá)到1:101920,Fba組效價可達(dá)到1:203840,三組間效價無顯著差異。 5攻毒后,PBS組小鼠在3天內(nèi)全部死亡,而P5+Mb組、Fba組、P5組生存率分別為80%、60%、20% ,經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析各實驗組與PBS組保護(hù)率有顯著差異。 6 GAS感染組小鼠心、腎體積明顯增大,HE染色顯示心瓣膜受損嚴(yán)重,腎小球腎小管組織被破壞,而P5+Mb組、P5組和Fba組與PBS組無顯著差異,即疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫因素對心、腎組織未造成破壞。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建、表達(dá)了P5+Mb、P5多肽和Fba蛋白。 2、P5+Mb、P5多肽和Fba蛋白免疫小鼠對GAS感染有保護(hù)作用,以P5+Mb更為突出,能產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。 3、P5+Mb、P5多肽和Fba蛋白疫苗與小鼠心、腎組織無免疫交叉反應(yīng)。
[Abstract]:Objective: A Group A Streptococcus (GAS) is one of the most common pathogenic Gram-positive bacteria in clinic, which can cause pyogenic infection, toxic diseases and various autoimmune diseases. Epidemiological investigation in 5 provinces and cities in China has found that the prevalence of group A streptococci infection in school age children aged 8 to 13 is up to 50%, which is even 70% to 80%[1] in some rural areas. Among all the diseases caused by GAS, acute glomerulonephritis and rheumatic fever caused by the upper respiratory tract infection of GAS are the most serious. Since there are many GAS serotypes and some immunogenic surface proteins may cross reaction with human proteins, there is no ideal vaccine for [2].
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳傳勇;婁加陶;蔣廷旺;錢，

本文編號：1341846