本文關(guān)鍵詞：A類(lèi)清道夫受體內(nèi)吞路徑的研究　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：A類(lèi)清道夫受體(Class A scavenger receptor, SR-A)是一種主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞的模式識(shí)別受體,在機(jī)體的自然免疫中發(fā)揮重要作用。SR-A還與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),其調(diào)控的異常是許多重要疾病的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。SR-A主要以吞噬多種多樣的配體而實(shí)現(xiàn)自身的功能。然而,SR-A內(nèi)吞路徑的分子機(jī)制目前尚不知曉。本課題分別應(yīng)用SR-A的兩個(gè)特異性配體—乙�；兔芏戎鞍�(acLDL)和巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan),深入探討了SR-A的不同內(nèi)吞路徑及其耦聯(lián)的下游信號(hào)通路,揭示了不同內(nèi)吞路徑所具有的生物學(xué)意義,為阻止巨噬細(xì)胞凋亡、防止脂質(zhì)在細(xì)胞中的過(guò)度積聚提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。 細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的受體配體復(fù)合物的內(nèi)吞主要有兩種形式:網(wǎng)格蛋白依賴(lài)型和小凹蛋白依賴(lài)型內(nèi)吞路徑。本課題首先想澄清,SR-A的內(nèi)吞路徑是什么?我們通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí),SR-A在RAW264.7巨噬細(xì)胞中可以分別與網(wǎng)格蛋白或者小凹蛋白-1相互結(jié)合。進(jìn)一步應(yīng)用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到,SR-A與網(wǎng)格蛋白或小凹蛋白-1共定位于RAW264.7細(xì)胞中。上述結(jié)果提示,SR-A可能同時(shí)依賴(lài)兩種內(nèi)吞路徑進(jìn)入細(xì)胞。 接著我們想知道,SR-A這兩條內(nèi)吞路徑的生物學(xué)意義是什么?為此,我們分別運(yùn)用了兩種方法特異性地阻斷這兩條內(nèi)吞路徑:一是通過(guò)SiRNA分別下調(diào)兩條內(nèi)吞路徑中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白—網(wǎng)格蛋白和小凹蛋白-1,從而阻斷相應(yīng)的內(nèi)吞路徑;二是運(yùn)用特異性化學(xué)阻斷劑氯丙嗪(CP)或nystatin,分別直接阻斷相應(yīng)的內(nèi)吞路徑。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)用SiRNA的方法網(wǎng)格蛋白下調(diào)約65%后,流式檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)吞acLDL的能力約被抑制60%,而小凹蛋白-1表達(dá)下調(diào)約60%時(shí),acLDL的內(nèi)吞大約抑制25%。使用內(nèi)吞化學(xué)阻斷劑重復(fù)這一實(shí)驗(yàn),得到了基本一致的結(jié)果,說(shuō)明acLDL可能主要通過(guò)網(wǎng)格蛋白路徑進(jìn)入細(xì)胞。SR-A的另一重要功能為介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡,為此我們還用同樣的方法檢測(cè)了不同內(nèi)吞路徑對(duì)SR-A介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)網(wǎng)格蛋白下調(diào)時(shí),SR-A介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡減少約11%-16%;而小凹蛋白-1表達(dá)下調(diào)時(shí),SR-A介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡下降約58%-78%。因此,SR-A介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡可能主要通過(guò)小凹蛋白路徑實(shí)現(xiàn)。 為了進(jìn)一步闡明SR-A內(nèi)吞路徑耦聯(lián)的下游信號(hào)通路,我們又進(jìn)行了以下研究。首先,我們分別檢測(cè)了acLDL和巖藻多糖分別與受體結(jié)合以及隨后的內(nèi)吞兩種情形下SR-A下游信號(hào)分子的激活情況。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在內(nèi)吞時(shí)無(wú)論acLDL還是巖藻多糖都可以激活MAPKs (p38, JNK, ERK)三個(gè)信號(hào)分子;但在配體與受體僅僅結(jié)合而不發(fā)生內(nèi)移的情況下(細(xì)胞置于4℃條件下),則只見(jiàn)acLDL可以激活MAPKs(p38, JNK, ERK)家族信號(hào)分子,而巖藻多糖卻不能激活上述信號(hào)分子。因此,本研究在后續(xù)的內(nèi)吞試驗(yàn)中只選用配體巖藻多糖,以避免配體與受體結(jié)合時(shí)可能激發(fā)的信號(hào)影響。使用SiRNA和化學(xué)阻斷劑分別阻斷特定的內(nèi)吞路徑后,再檢測(cè)巖藻多糖對(duì)MAPKs(p38, JNK, ERK)信號(hào)分子激活的影響,結(jié)果表明,當(dāng)阻斷網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞路徑后,巖藻多糖激活的ERK信號(hào)分子受到明顯抑制,p38和JNK信號(hào)分子激活不受影響;當(dāng)阻斷小凹蛋白內(nèi)吞路徑后,巖藻多糖激活的p38和JNK信號(hào)分子會(huì)受到明顯抑制,而ERK信號(hào)分子的激活不受影響。這就提示,SR-A網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞路徑可能與ERK信號(hào)通路相耦聯(lián),而小凹蛋白內(nèi)吞路徑與p38和JNK信號(hào)通路相耦聯(lián)。 最后,我們想進(jìn)一步明確SR-A耦聯(lián)的下游信號(hào)通路和功能之間的關(guān)系。在研究中我們分別使用了p38、JNK和ERK三個(gè)信號(hào)分子的化學(xué)抑制劑(SB203580,SP600125,PD98059)來(lái)特異性地抑制這三個(gè)信號(hào)分子的激活,隨后觀察對(duì)SR-A依賴(lài)性的巨噬細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)p38和JNK激活受到抑制后,SR-A介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡也明顯受到抑制;而ERK信號(hào)抑制后則無(wú)此現(xiàn)象出現(xiàn)。因此,p38和JNK信號(hào)通路可能為SR-A依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡所必需。 總之,本課題研究結(jié)果顯示,SR-A作為巨噬細(xì)胞表面的一類(lèi)重要受體蛋白,同時(shí)具備網(wǎng)格蛋白依賴(lài)型和小凹蛋白依賴(lài)型兩種內(nèi)吞路徑。其配體巖藻多糖經(jīng)由小凹蛋白路徑內(nèi)吞時(shí),通過(guò)激活下游的p38和JNK信號(hào)途徑,進(jìn)一步引起SR-A依賴(lài)性巨噬細(xì)胞凋亡。如果巖藻多糖通過(guò)網(wǎng)格蛋白路徑內(nèi)吞時(shí),則激活下游ERK信號(hào)分子,其具體的生物學(xué)意義尚不明了。SR-A介導(dǎo)的脂質(zhì)內(nèi)吞主要通過(guò)網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞路徑。上述研究結(jié)果從分子水平上解釋了SR-A功能多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ):由于存在不同的內(nèi)吞方式,使得SR-A在與不同的配體甚至是同一種配體發(fā)生反應(yīng)時(shí),通過(guò)選擇不同的內(nèi)吞通路,表現(xiàn)出特定的生物學(xué)功能。 由于SR-A在調(diào)控巨噬細(xì)胞多項(xiàng)重要功能的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,因此對(duì)于SR-A內(nèi)吞路徑的闡明,有利于今后更加深入地認(rèn)識(shí)SR-A選擇性調(diào)控機(jī)制,并為相關(guān)重要疾病的診治提供了新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:Class A scavenger receptor (SR-A) is a pattern recognition receptor mainly expressed in macrophages, and plays an important role in the body's natural immunity. SR-A is also closely related to the occurrence of a variety of diseases, and the abnormality of its regulation is the important pathophysiological basis of many important diseases. SR-A realizes its own function mainly by phagocytosis a variety of ligands. However, the molecular mechanism of the SR-A endocytosis path is not yet known. This paper applied two SR-A specific ligand - acetylated low density lipoprotein (acLDL) and fucoidan (fucoidan), discussed the SR-A different endocytic pathways and the coupled signaling pathway to reveal the biological significance of different endocytic pathways of macrophage apoptosis, in order to prevent. Provide new targets for intervention to prevent excessive accumulation of lipid in the cell.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1341594