肺炎鏈球菌所引發(fā)的疾病在全球的發(fā)病率和死亡率非常高,人數(shù)最多的是老人和兒童。已有實(shí)驗(yàn)證明其莢膜多糖是TI抗原,再次免疫不能使降低的抗體達(dá)到初次免疫的水平,不能誘導(dǎo)免疫記憶細(xì)胞的產(chǎn)生。若將其共價(jià)連接到蛋白卻使之成為TD抗原,能夠?qū)胗變汉屠先水a(chǎn)生抗體,免疫效果會(huì)得到提高。因此研究肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗具有重要意義。論文以3型肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合工藝的研究為對(duì)象,通過對(duì)3型莢膜多糖水解預(yù)處理,分子篩,氧化醛基,超濾,共價(jià)結(jié)合CRM197蛋白,SDS-PAGE電泳,液相純化工藝流程研制結(jié)合疫苗,并通過動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)觀察免疫原性。首先研究了多糖水解預(yù)處理方法,從不同水解溫度和不同水解時(shí)間兩個(gè)方面,通過分子篩的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)隨著溫度和時(shí)間的增加,分子量變得越來越小。在85℃下用0.2 mol/L乙酸溶液水解1.0 h,可以得到分子量較大的結(jié)合產(chǎn)物,游離蛋白很少；其次多糖活化過程中發(fā)現(xiàn)活化反應(yīng)16h以后,多糖溶液中高碘酸鈉基本已經(jīng)反應(yīng)完全。隨著加入高碘酸鈉的濃度升高,活化度降低,超濾后的多糖回收率也逐漸降低。加入0.4 g/L高碘酸鈉,活化度為10左右,活化多糖的回收率在78%左右；然后結(jié)合過程中,通過從反應(yīng)體系容器,結(jié)合反應(yīng)時(shí)間,投料比,多糖和蛋白回收率四個(gè)方面的優(yōu)化研究結(jié)合疫苗,發(fā)現(xiàn)在4 mL體系中選用50 mL離心管,多糖和蛋白的投料比為20：10,加入7倍醛基含量的氰基硼氫化鈉,在37℃下反應(yīng)48 h時(shí),利用SDS-PAGE電泳,液相純化和超濾可以獲得收率較高,沒有游離蛋白的大分子量結(jié)合產(chǎn)物；最后純化后的結(jié)合產(chǎn)物用高壓滅菌的生理鹽水和5 mmol/L pH 5.8琥珀酸緩沖液配制成疫苗,通過BALB/C小鼠免疫實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),85℃下水解1.0 h多糖,活化度10左右時(shí),多糖蛋白投料比為20：10時(shí)獲得的結(jié)合疫苗免疫原性相對(duì)來說最好。
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392-33
文章目錄
摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 肺炎鏈球菌肺炎疾病的概述
1.1.1 肺炎鏈球菌概述
1.1.2 肺炎鏈球菌所致疾病
1.1.3 肺炎鏈球菌致病機(jī)制及機(jī)體反應(yīng)
1.1.4 肺炎鏈球菌疾病的流行病學(xué)
1.1.5 肺炎鏈球菌肺炎的診斷和防控現(xiàn)狀
1.2 肺炎鏈球菌疫苗進(jìn)展
1.3 肺炎鏈球菌多糖疫苗
1.4 肺炎鏈球菌多糖蛋白疫苗
1.4.1 結(jié)合疫苗概述
1.4.2 結(jié)合疫苗的免疫機(jī)理
1.4.3 肺炎結(jié)合疫苗的國內(nèi)外進(jìn)展
1.4.4 結(jié)合疫苗的結(jié)合化學(xué)
1.4.5 結(jié)合疫苗的指標(biāo)控制
1.5 載體蛋白
1.6 本論文的研究目的和主要內(nèi)容
1.6.1 本論文的研究目的
1.6.2 本論文的主要研究?jī)?nèi)容
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 多糖發(fā)酵液與載體蛋白
2.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要溶液的配制
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 肺炎鏈球菌血清型3型多糖發(fā)酵液的純化方法
2.2.2 純化多糖中醛酸的檢測(cè)方法
2.2.3 活化多糖產(chǎn)生的醛基檢測(cè)方法
2.2.4 多糖濃度的檢測(cè)方法
2.2.5 蛋白濃度的檢測(cè)方法
2.2.6 HPSEC-MALS-RI聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)定多糖和多糖蛋白結(jié)合物分子量及分子大小分布
2.2.7 多糖蛋白結(jié)合產(chǎn)物分布的鑒定方法
2.2.8 多糖蛋白結(jié)合產(chǎn)物的純化方法
2.2.9 免疫血清效價(jià)的檢測(cè)方法
2.3 多糖水解研究
2.3.1 不同水解溫度對(duì)3型多糖分子量的影響
2.3.2 不同水解時(shí)間對(duì)3型多糖分子量的影響
2.4 多糖活化研究
2.4.1 活化反應(yīng)時(shí)間對(duì)3型多糖性質(zhì)的影響
2.4.2 不同高碘酸鈉濃度對(duì)3型多糖活化度的影響
2.4.3 活化度對(duì)多糖回收率的影響
2.5 多糖蛋白結(jié)合工藝研究
2.5.1 結(jié)合工藝中條件的控制研究
2.5.2 不同水解溫度處理的3型多糖與CRM197在水相中的結(jié)合
2.5.3 不同水解時(shí)間處理的3型多糖與CRM197在水相中的結(jié)合
2.5.4 不同活化度的3型活化多糖與CRM197在水相中的結(jié)合
2.6 多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的研究
2.6.1 不同水解溫度處理的結(jié)合產(chǎn)物的免疫原性
2.6.2 不同水解時(shí)間處理的多糖蛋白結(jié)合產(chǎn)物的免疫原性
2.6.3 不同活化度多糖蛋白結(jié)合產(chǎn)物的免疫原性
3 結(jié)果與討論
3.1 純化多糖檢測(cè)結(jié)果
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果
3.2.1 多糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
3.2.2 蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
3.2.3 醛基檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
3.3 多糖水解研究結(jié)果
3.3.1 不同水解溫度分子量
3.3.2 不同水解時(shí)間分子量
3.3.3 水解小結(jié)
3.4 多糖活化研究結(jié)果
3.4.1 活化反應(yīng)時(shí)間的影響
3.4.2 不同高碘酸鈉濃度對(duì)3型多糖活化度的影響
3.4.3 活化度對(duì)活化過程中多糖收率影響
3.4.4 膜包孔徑對(duì)多糖回收工藝的影響
3.4.5 活化反應(yīng)小結(jié)
3.5 多糖蛋白結(jié)合結(jié)果
3.5.1 結(jié)合工藝中條件的控制研究
3.5.2 不同水解溫度多糖結(jié)合的結(jié)果
3.5.3 不同水解時(shí)間多糖結(jié)合的結(jié)果
3.5.4 不同活化度多糖結(jié)合結(jié)果
3.5.5 結(jié)合比的比較
3.5.6 結(jié)合反應(yīng)小結(jié)
3.6 多糖蛋白結(jié)合物免疫原性研究
3.6.1 不同水解溫度結(jié)合物免疫原性結(jié)果
3.6.2 不同水解時(shí)間結(jié)合物免疫原性結(jié)果
3.6.3 不同活化度結(jié)合物免疫原性結(jié)果
3.6.4 不同投料比結(jié)合物免疫原性結(jié)果
3.6.5 結(jié)合產(chǎn)物免疫原性小結(jié)
4 結(jié)論
5 展望
6 參考文獻(xiàn)
7 攻讀碩士研究生學(xué)位期間發(fā)表論文情況
8 致謝
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本文編號(hào)：
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