發(fā)布時間：2017-12-09 10:03

  本文關(guān)鍵詞：狨猴血清中重組人5型腺病毒中和抗體滴度的測定

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【摘要】：目的構(gòu)建表達(dá)熒光素酶與綠色熒光蛋白報(bào)告基因的重組人5型腺病毒r Ad5/Luc/GFP,檢測血清中和抗體最佳實(shí)驗(yàn)方法,分析小型靈長類動物普通棉耳狨猴體內(nèi)腺病毒5型中和抗體水平,為評價(jià)腺病毒載體疫苗提供實(shí)驗(yàn)動物基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法利用ADMax包裝系統(tǒng),首先構(gòu)建穿梭質(zhì)粒p DC315-Luc-GFP,將所得的穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒p BHGloxΔE1,3Cre共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,進(jìn)行重組人5型腺病毒(r Ad5/Luc/GFP)的包裝。通過3次空斑形成實(shí)驗(yàn)篩選出單克隆重組腺病毒,并在大量擴(kuò)增單克隆腺病毒后用Cs Cl密度梯度離心法進(jìn)行濃縮純化。采用TCID50法測定純化后病毒滴度,并挑選進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)病毒滴度。將合適病毒滴度的r Ad5/Luc/GFP與狨猴血清混合預(yù)孵育后感染293A細(xì)胞,分別采用化學(xué)發(fā)光法及流式細(xì)胞術(shù),對14只普通棉耳狨猴血清中腺病毒5型中和抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果 PCR、酶切和測序結(jié)果均表明穿梭質(zhì)粒p DC315-Luc-GFP構(gòu)建成功;GFP檢測結(jié)果證明重組人5型腺病毒r Ad5/Luc/GFP包裝擴(kuò)增成功,病毒滴度可達(dá)6.9×1011.5PFU/m L。兩種不同方法檢測檢測14只狨猴的中和抗體結(jié)果一致性較好(P0.05,Kappa=0.811),化學(xué)發(fā)光法或流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性狨猴比率分別為28.6%(4/14)或21.4%(3/14),化學(xué)發(fā)光法檢測得其中2只狨猴中和抗體滴度為1/16,另2只為1/32,而流式細(xì)胞術(shù)檢測得滴度均為1/16。結(jié)論化學(xué)發(fā)光法是一種快速,準(zhǔn)確,適用于多物種的方法,其靈敏度略高于以GFP為報(bào)告基因的流式細(xì)胞術(shù)(7.2%)。普通棉耳狨猴體內(nèi)Ad5血清陽性率較低,有望應(yīng)用基于此型或其他型別腺病毒作為載體進(jìn)行基因治療和基因疫苗研究。
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)輸血醫(yī)學(xué)系;深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司;
【基金】：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(31500134) 廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)(201508020061) 廣州市珠江科技新星專項(xiàng)(201506010075) 廣東省教育廳青年創(chuàng)新人才類項(xiàng)目(2014KQNCX048) 南方醫(yī)科大學(xué)優(yōu)秀青年教師培育計(jì)劃 深圳市食品安全快速檢測技術(shù)工程中心(GCZX20140509163151273)~~
【分類號】：R373
【正文快照】： 普通棉耳狨猴(Callithrix jacchus)是新大陸猴,屬靈長目狨猴科,地理分布上只分布在南美巴西的中部和東北部的大西洋沿岸。具有體型小、易管理、經(jīng)濟(jì)性好、繁殖率高的靈長類實(shí)驗(yàn)動物的優(yōu)點(diǎn),近年來作為動物模型已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的多項(xiàng)研究[1-2]。隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)

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本文編號：1269971