發(fā)布時(shí)間：2017-12-03 10:30

  本文關(guān)鍵詞：低溫保存對(duì)小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞生物特性的影響

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【摘要】：目的：探討兩種不同低溫保存方法對(duì)小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞生物特性的影響。方法：1、小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與分組頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠,在無菌條件下獲得小鼠骨髓細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,分成三組：A組(常規(guī)培養(yǎng))、B組(早期凍存)及C組(培養(yǎng)后凍存),其中A組單細(xì)胞懸液加入rmGM-CSF和rmIL-4后分裝于2個(gè)透氣培養(yǎng)瓶培養(yǎng),48小時(shí)后離心去除上清液,并補(bǔ)充含12% FBS的RPMI 1640全培養(yǎng)液和細(xì)胞因子繼續(xù)培養(yǎng),B組單細(xì)胞懸液直接凍存,C組前5天培養(yǎng)同A組,第5天經(jīng)自然沉降后收集懸浮細(xì)胞用于凍存。2、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇后培養(yǎng)用于凍存的細(xì)胞經(jīng)洗滌、離心后,重懸于自制凍存液(70% RPMI 1640全培養(yǎng)液,20% FBS,10% DMSO),在-20℃下保存1小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱,24小時(shí)后轉(zhuǎn)移到液氮罐中,4周后復(fù)蘇。B組復(fù)蘇后按A組步驟繼續(xù)培養(yǎng)出DCs。C組制成單細(xì)胞懸液,加入rmGM-CSF和rmIL-4,繼續(xù)培養(yǎng)一天,換液后并再次補(bǔ)充細(xì)胞因子,隔日后收集細(xì)胞懸液。3、觀察細(xì)胞存活率將復(fù)蘇后的B、C兩組細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算DCs存活率。細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞分子表型分別收集各組DCs懸液,按照流式抗體說明書進(jìn)行抗體及其同型對(duì)照標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞表面CH11c、CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表達(dá)。5、CCK-8法檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)無菌條件下取BALB/c小鼠脾臟并剪碎,經(jīng)研磨、過濾后得到細(xì)胞懸液,用淋巴細(xì)胞分離液獲得淋巴細(xì)胞,尼龍毛柱法獲得同種異體T細(xì)胞。取上述方法獲得的各組成熟樹突狀細(xì)胞,加入絲裂霉素C在37℃下孵育45min,洗滌后,按1：5、1：10、1：20、1：40的比例分別將DCs和T細(xì)胞加入96孔板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)DCs和T細(xì)胞作陰性對(duì)照,培養(yǎng)液作為空白對(duì)照,兩者共培養(yǎng)68h后,每孔加入10μl CCK8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,用酶標(biāo)儀測(cè)定450nnm處各孔OD值(optical density)。6、Elisa法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-10、TGF-β1水平收集上述各組未成熟DCs細(xì)胞上清液,按Elisa試劑盒說明書步驟測(cè)定培養(yǎng)上清液DL-10、TGF-β1水平。結(jié)果：1、兩組經(jīng)過凍存的DCs復(fù)蘇后存活率分別為(85±3.9)%和(83±6.1)%,存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05；2、三組DCs均高表達(dá)CDllc,低表達(dá)CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子；3、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)提示B、C兩組DCs刺激同種異基因T細(xì)胞增殖的能力與A組相比較有所下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；4、三組培養(yǎng)上清液中IL-10、TGF-β1水平的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：經(jīng)過低溫保存的imDCs和小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)低溫保存后分化成的imDCs仍能保持穩(wěn)定的生物學(xué)特性,可以用于小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞免疫治療。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

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