本文關(guān)鍵詞：霍亂弧菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AphBC端結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)與純化結(jié)晶

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【摘要】：目的 AphB是霍亂弧菌毒力基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可激活毒力基因表達(dá),本實驗?zāi)康脑谟诘玫紸phB蛋白C端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu),為研究其與輔助誘導(dǎo)物結(jié)合之后的構(gòu)象改變對于毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響奠定基礎(chǔ)。方法以霍亂弧菌的AphB蛋白C端結(jié)構(gòu)域為對象,將目的基因克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)上,使重組質(zhì)粒在大腸埃希菌中高效表達(dá)目的蛋白,然后利用鎳離子親和層析、MonoQ離子交換層析和GF75凝膠過濾層析法進(jìn)行純化。分別選取5、10、20和30mg/ml的目的蛋白,采用懸滴氣相擴(kuò)散法進(jìn)行蛋白結(jié)晶,篩選結(jié)晶試劑盒條件,在得到初晶的結(jié)晶條件基礎(chǔ)上通過改變蛋白與池液混合比例、結(jié)晶池液成分、環(huán)境溫度等進(jìn)行結(jié)晶條件的優(yōu)化。結(jié)果含有目的基因的重組質(zhì)粒在大腸埃希菌中高效表達(dá)可溶性目的蛋白。利用3種蛋白純化方法依次進(jìn)行純化,得到較高純度的目的蛋白。對蛋白結(jié)晶試劑盒結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化,得到的最優(yōu)結(jié)晶條件為:蛋白濃度為30mg/ml;池液成分為0.1mol/L BIS-TRIS,2.0mol/L Ammonium sulfate,pH 5.0,18℃環(huán)境孵育24h。用優(yōu)化的結(jié)晶條件進(jìn)行結(jié)晶處理,得到分辨率為2.1姒的蛋白晶體。結(jié)論通過原核表達(dá)和用優(yōu)化的結(jié)晶條件得到了霍亂弧菌AphB蛋白C端結(jié)構(gòu)域的蛋白晶體,所得數(shù)據(jù)為蛋白的空間結(jié)構(gòu)解析提供了重要依據(jù),對蛋白C端結(jié)構(gòu)域與輔助誘導(dǎo)物結(jié)合的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 承德醫(yī)學(xué)院;南京農(nóng)業(yè)大學(xué);
【分類號】：R378.3
【正文快照】： *?霍亂(Cholera)是一種烈性、急性腹瀉疾病,其發(fā)病急劇、傳播快、影響大,被世界衛(wèi)生組織確定為國際檢疫傳染病[1-3],霍亂弧菌(Vibrio cholerae)作為該病的病原體倍受關(guān)注[4]。研究表明,霍亂弧菌具有復(fù)雜、高效的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),可以在不同的環(huán)境條件下對一系列基因進(jìn)行相應(yīng)，

本文編號：1211772