本文關(guān)鍵詞：染料木黃酮抑制人巨細(xì)胞病毒即刻早期蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 染料木黃酮 人巨細(xì)胞病毒 即刻早期蛋白 組蛋白乙�；�

【摘要】：目的:1.探究人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirous,HCMV)感染人星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes,AS)即刻早期蛋白IE72表達(dá)變化。2.通過檢測染料木黃酮(Genistein,Gen)抑制HCMV感染AS引起的即刻早期蛋白IE72及其m RNA的表達(dá)變化,以此探討Gen對(duì)HCMV感染AS的影響。再檢測IE72基因啟動(dòng)子區(qū)域(major immediate early promoter,MIEP)組蛋白乙�；�,進(jìn)一步探討Genistein抑制人星形膠質(zhì)細(xì)胞HCMV感染的分子生物學(xué)機(jī)制。方法:1.純化新取材的原代AS,免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白——膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。2.MTT檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞活性。3.分別用Real-time PCR和Western blot檢測IE72m RNA和蛋白的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)分為HCMV組、Gen組、用含40μM Gen的2%DMEM/F12培養(yǎng)液預(yù)處理細(xì)胞4h后,以MIO=5的HCMV感染AS組(Gen+HCMV組)、細(xì)胞培養(yǎng)至基本融合后更換含2%FBS的D/F12維持培養(yǎng),以MIO=5的HCMV感染AS,置恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去培養(yǎng)液,更換含40μM Gen的2%DMEM/F12培養(yǎng)液組(HCMV+Gen組)和對(duì)照組。4.染色質(zhì)免疫共沉淀法(Ch IP)檢測HCMV組、Gen+HCMV組、HCMV+Gen組和對(duì)照組的主要即刻早期基因啟動(dòng)子區(qū)域(MIEP)組蛋白H3乙酰化水平。結(jié)果:1.Cy3標(biāo)記的抗GFAP顯示95%以上細(xì)胞為AS。2.MTT顯示:40μM Gen+HCMV組24 h、48 h、72 h的吸光值顯著高于HCMV組(P0.05);病毒形態(tài)感染48h后,HCMV組細(xì)胞有明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),40μMGen+HCMV組細(xì)胞狀態(tài)良好。3.RT-q PCR結(jié)果顯示:感染24h、48h、72 h和96h時(shí)HCMV+Gen組及Gen+HCMV組IE72的m RNA表達(dá)明顯低于HCMV組(P0.05)。4.Western blot結(jié)果顯示:感染HCMV+Gen組及Gen+HCMV組細(xì)胞的IE72蛋白表達(dá)都明顯低于HCMV組(P0.05)。5.Ch IP法提取MIEP組蛋白H3乙�；慕Y(jié)果顯示:Gen+HCMV組和HCMV+Gen組的水平明顯低于HCMV組。結(jié)論:1.HCMV能夠感染原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,是其容許細(xì)胞。2.適當(dāng)濃度的Gen能抑制HCMV感染AS后IE72基因和蛋白表達(dá)。3.Gen抑制HCMV IE72基因和蛋白表達(dá)可能是通過Gen抑制MIEP組蛋白H3乙酰化來實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：染料木黃酮 人巨細(xì)胞病毒 即刻早期蛋白 組蛋白乙�；�
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-7
• 引言7-8
• 第一章 實(shí)驗(yàn)材料8-12
• 1.1 材料8-10
• 1.1.1 細(xì)胞8
• 1.1.2 病毒8
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物8
• 1.1.4 試劑8-9
• 1.1.5 儀器設(shè)備9-10
• 1.2 主要試劑配制10-12
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方法12-20
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)12-13
• 2.2 HCMV AD169株毒種的制備和定量13-14
• 2.3 MTT比色法檢測染料木黃酮對(duì)AS細(xì)胞增殖作用的影響14
• 2.4 RT-qPCR檢測HCMVIE72 mRNA水平表達(dá)的變化14-16
• 2.5 蛋白提取與Western blot16-17
• 2.6 ChIP實(shí)驗(yàn)檢測IE啟動(dòng)子區(qū)域（MIEP）組蛋白乙�；�17-20
• 第三章 結(jié)果20-28
• 3.1 人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的取材、純化及鑒定20
• 3.2 人胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)20-21
• 3.3 HCMV AD169毒株的擴(kuò)增和定量21
• 3.4 各組細(xì)胞感染HCMV 24和 48h的形態(tài)學(xué)觀察21-23
• 3.5 MTT比色法檢測染料木黃酮對(duì)AS細(xì)胞增殖作用的影響23-24
• 3.6 HCMV組、HCMV+Gen組和Gen+HCMV組細(xì)胞感染HCMV IE mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量24-25
• 3.7 各組細(xì)胞感染HCMV 1、2、3 和 4 d時(shí)Western blot檢測IE蛋白水平的變化25-26
• 3.8 ChIP法MIEP乙�；瘷z測結(jié)果26-28
• 第四章 討論28-31
• 參考文獻(xiàn)31-34
• 綜述 染料木黃酮與HCMV感染34-45
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 致謝45-46

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本文編號(hào)：1106714