本文關(guān)鍵詞：核酸適配體對(duì)沙門氏菌的檢測及其菌膜的控制

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【摘要】：沙門氏菌是一類常見的人畜共患致病菌,由家禽、鳥畜等傳染給人類,易引起胃腸炎、敗血癥、傷寒等感染性疾病,給人類和動(dòng)物健康造成巨大威脅。其中,以甲型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌較為常見。由沙門氏菌形成的細(xì)菌菌膜在宿主體內(nèi)以及自然環(huán)境當(dāng)中廣泛存在,造成疾病難以治愈和反復(fù)發(fā)作。由甲型副傷寒沙門氏菌可引起的疾病仍在全球范圍內(nèi)持續(xù)發(fā)生,并越來越引起人類的關(guān)注,因此對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌的實(shí)時(shí)快速檢測已成為必要。豬霍亂沙門氏菌以侵害4個(gè)月以下的斷奶仔豬為主,誘發(fā)仔豬腸道疾病,給養(yǎng)殖業(yè)造成直接經(jīng)濟(jì)損失。加之其菌膜的形成加劇了菌膜細(xì)菌的耐藥性,因此發(fā)展新方案用于豬霍亂沙門氏菌及其菌膜的控制已迫在眉睫。(1)甲型副傷寒沙門氏菌的高靈敏性循環(huán)信號(hào)放大檢測。本實(shí)驗(yàn)以熒光疊加、熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)以及限制性核酸內(nèi)切酶酶解作用為基本原理,構(gòu)建了一種簡單、低成本的DNA適配體傳感器用于甲型副傷寒沙門氏菌的熒光檢測。該傳感器由一條經(jīng)過延伸的適配體序列、兩條末端修飾上FAM的短序列(探針1和探針2)構(gòu)成。當(dāng)靶標(biāo)不存在時(shí),由于適配體傳感器與靶標(biāo)的特異性結(jié)合,修飾上FAM的適配體傳感器被吸附到氧化石墨烯上,FAM熒光被淬滅;當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí),修飾上FAM的適配體傳感器從氧化石墨烯表面釋放出來,從而檢測到FAM熒光信號(hào)。重要的是,熒光信號(hào)可以通過核酸內(nèi)切酶I介導(dǎo)的靶標(biāo)循環(huán)放大。在最優(yōu)條件下,靶標(biāo)濃度在1×102到1×1011cells/mL范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,且最低檢測下限為1×102 cells/mL。因此,證明該種檢測平臺(tái)對(duì)致病菌的檢測提供了一種高靈敏性和高特異性的檢測方法,并為其他細(xì)菌的檢測提供了可能性。(2)核酸適配體-氨芐青霉素共軛物對(duì)豬霍亂沙門氏菌菌膜的控制。本實(shí)驗(yàn)以豬霍亂沙門氏菌菌膜為研究對(duì)象,以適配體和氨芐青霉素的分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),以酰胺反應(yīng)為連接原理,探索了一種能通過協(xié)同作用控制菌膜的新方法。在靶細(xì)菌鞭毛蛋白適配體(aptamer 3)的3’-末端上修飾氨基,通過酰胺反應(yīng)使之與氨芐青霉素上的羧基共軛以形成多功能共軛物(Apt-Amp共軛物)。光譜研究確定了共軛物的正確合成,熒光分光光度法證明共軛物保留了適配體的特異性。倒置顯微鏡和原子力顯微鏡(AFM)顯微鏡觀察結(jié)果表明,共軛物對(duì)菌膜具有良好的控制作用。共軛物菌膜抑制效果為71.64%,菌膜消減效果為60.00%,而且效果均優(yōu)于組分(適配體、抗生素),推測共軛物以協(xié)同作用方式作用于菌膜。初步推測其作用機(jī)理是利用適配體對(duì)豬霍亂沙門氏菌鞭毛蛋白的特異性識(shí)別作用附著在菌膜細(xì)菌的表面,進(jìn)而將氨芐青霉素帶入菌膜,發(fā)揮其自身以及氨芐青霉素的聯(lián)合抗菌作用以抑制和消減菌膜。
【關(guān)鍵詞】：沙門氏菌 適配體 核酸內(nèi)切酶I 氧化石墨烯 菌膜 氨芐青霉素
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.6;R378
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 引言和文獻(xiàn)綜述13-28
• 1.1 沙門氏菌13-16
• 1.1.1 沙門氏菌的概述及分類13-14
• 1.1.2 沙門氏菌的流行和危害14
• 1.1.3 沙門氏菌的致病機(jī)理14-15
• 1.1.4 沙門氏菌的檢測和治療15-16
• 1.2 核酸適配體16-19
• 1.2.1 適配體的體外篩選17
• 1.2.2 適配體與靶標(biāo)的作用機(jī)理17-18
• 1.2.3 適配體的特點(diǎn)18
• 1.2.4 適配體的應(yīng)用及展望18-19
• 1.3 納米材料19-20
• 1.3.1 氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)19
• 1.3.2 氧化石墨烯在傳感器中的應(yīng)用19-20
• 1.4 核酸內(nèi)切酶20-21
• 1.4.1 核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用20
• 1.4.2 脫氧核糖核酸酶I的作用20-21
• 1.5 細(xì)菌菌膜21-24
• 1.5.1 菌膜的成分及特點(diǎn)22
• 1.5.2 菌膜的形成過程22-23
• 1.5.3 菌膜的致病機(jī)理23-24
• 1.5.4 菌膜的治療現(xiàn)狀24
• 1.6 抗生素24-26
• 1.6.1 氨芐青霉素的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用25
• 1.6.2 氨芐青霉素的生成及結(jié)構(gòu)25-26
• 1.7 本課題的研究內(nèi)容26-28
• 第二章 DNase I介導(dǎo)的適配體傳感器對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌的高靈敏性循環(huán)放大檢測28-42
• 2.1 引言28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分29-33
• 2.2.1 材料與設(shè)備29-30
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 2.3 結(jié)果與討論33-41
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理33-35
• 2.3.2 反應(yīng)體系優(yōu)化35-36
• 2.3.3 體系可行性分析36-37
• 2.3.4 瓊脂糖凝膠電泳分析37-38
• 2.3.5 適配體傳感器對(duì)靶細(xì)菌的靈敏性分析38-39
• 2.3.6 適配體傳感器對(duì)靶細(xì)菌的特異性分析39-40
• 2.3.7 適配體傳感器在實(shí)際樣品中的應(yīng)用40-41
• 2.4 小結(jié)41-42
• 第三章 適配體輔助的氨芐青霉素作用于豬霍亂沙門氏菌菌膜的功能研究42-61
• 3.1 引言42-43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分43-49
• 3.2.1 材料與設(shè)備43-45
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法45-49
• 3.3 結(jié)果與討論49-59
• 3.3.1 適配體及其濃度、氨芐青霉素濃度確定49-50
• 3.3.2 Apt-Amp共軛物鑒定50-53
• 3.3.3 Apt-Amp共軛物對(duì)靶細(xì)菌的特異性檢測分析53
• 3.3.4 Apt-Amp共軛物對(duì)菌膜的抑制53-55
• 3.3.5 Apt-Amp共軛物對(duì)菌膜的消減55-56
• 3.3.6 倒置熒光顯微鏡結(jié)果分析56-57
• 3.3.7 原子力顯微鏡結(jié)果分析57-59
• 3.4 小結(jié)59-61
• 第四章 結(jié)論與展望61-63
• 4.1 結(jié)論61-62
• 4.2 展望62-63
• 參考文獻(xiàn)63-72
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫、發(fā)表的學(xué)術(shù)論文72-73
• 致謝73-74
• 附錄74

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本文編號(hào)：1042663