本文關鍵詞：家鼠及野鼠攜帶乙腦病毒的調(diào)查和乙腦病毒感染NIH小鼠模型的建立

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【摘要】：研究背景和目的流行病乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE),又稱為日本腦炎,簡稱乙腦。由流行性乙型腦炎病毒感染引起,在世界各地都有報道,尤其是亞洲、西太平洋國家和澳大利亞等。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,在全球24個國家和地區(qū)每年約有67900乙腦病例發(fā)生。乙腦的病死率為20%-30%,罹患乙腦的幸存患者中約有30%-50%會留有嚴重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。我國乙腦發(fā)病具有明顯的季節(jié)性,病例報道主要見于6-10月,乙腦的發(fā)病高峰為每年的7-8月,與蚊蟲的生長相關。我國乙腦病例主要見于15歲以下的兒童,約占90%,成人較少發(fā)病。流行性乙型腦炎病毒,簡稱乙腦病毒(Japanese encephalitis virus),屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus).乙腦病毒基因組為單股正鏈RNA,全長約11kb。病毒核酸具有一個開放閱讀框(open reading fram,ORF),從5'至3'端依次編碼3個結構蛋白(C蛋白、M前體或者M蛋白、E蛋白)和7個非結構蛋白(NSK、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。乙腦病毒通過蟲媒進行傳播,主要的傳播媒介為三帶喙庫蚊。蚊蟲叮咬吸血處于病毒血癥期的感染動物而帶毒,乙腦病毒在蚊體內(nèi)經(jīng)過一個外潛伏期,病毒量增殖,再通過叮咬吸血的方式將病毒傳播給易感動物或人。豬是乙腦病毒主要的傳染源。一些水鳥,如蒼鷺、白鷺等鷺科動物以及蝙蝠可能是乙腦病毒重要的保存宿主。人類感染乙腦病毒后,血液中病毒載量低,而且病毒血癥持續(xù)的時間較短,無傳染性和保存宿主的作用,被認為是乙腦病毒的終末宿主(dead end host).據(jù)報道,多種溫血動物均可攜帶乙腦病毒,如牛、羊、蝙蝠、鳥類等。但由于缺乏大規(guī)模的流行病學調(diào)查資料,這些動物在乙腦病毒傳播過程中扮演的角色并不十分明確。鼠類屬于哺乳動物綱,嚙齒目,鼠科,種屬多,數(shù)量大,廣泛分布于世界。根據(jù)鼠類與人類的接觸密切程度,又可分為家棲和野棲兩類。廣東地區(qū)常見的家鼠主要有褐家鼠、黃胸鼠和小家鼠三種；野鼠主要是黃毛鼠,又稱羅賽鼠、田鼠。鼠是重要的病毒性人獸共患病儲存宿主。國內(nèi)外學者已從鼠形動物體內(nèi)檢測出數(shù)十種病毒,例如漢坦病毒、戊肝病毒、正痘病毒、丙肝病毒、森林腦炎病毒、博爾瓦納病毒、諾如病毒等。目前,尚未有研究報道家鼠或野鼠在乙腦病毒自然史扮演的角色。但已經(jīng)有研究報道從鼠身上分離出其他黃病毒,如蜱傳森林腦炎病、西尼羅河病毒、登革病毒等,提示鼠可能對黃病毒科普遍易感,有潛在感染或攜帶乙腦病毒的風險。而實驗小鼠常被用作為乙腦病毒的感染模型。據(jù)報道,實驗鼠天生缺乏對黃病毒抵抗的基因,因此,對黃病毒有高度的易感性。顱內(nèi)接種3日齡的乳鼠常用于乙腦病毒的擴增。而成年實驗鼠感染了乙腦病毒后,會出現(xiàn)跟人類乙腦病例相似的癥狀,如弓背、震顫、強直痙攣、癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)相關癥狀。有研究采用腹腔注射乙腦病毒的方式感染實驗小鼠后出現(xiàn)病毒血癥,說明鼠存在攜帶或傳播乙腦病毒的風險。但目前尚缺乏對家鼠和野鼠是否能攜帶乙腦病毒的報道。因此,我們赴福建省和廣東省采集家鼠和野鼠的樣本,檢測其是否攜帶乙腦病毒,并且建立乙腦病毒感染的小鼠模型,檢驗其攜帶乙腦病毒的能力。研究方法1、家鼠和野鼠樣本的采集2013—2015年在廣州市以及廈門市部分公園、醫(yī)院、農(nóng)貿(mào)市場、學校等地方捕鼠。鼠籠放置的地點主要有建筑墻角、下水道、草叢、垃圾桶旁等。心臟采血處死,無菌開顱,取出部分腦組織。血液樣本靜置1h后,3 500g/min離心15min,分離出上層血清。采集的標本置于,-80℃冰箱保存,待檢。2、家鼠和野鼠腦組織樣本乙腦病毒的檢測采用Roche High Pure viral RNA kit提取鼠腦組織病毒RNA,用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,利用熒光定量RT-PCR法和普通RT-PCR法檢測腦組織中的乙腦病毒。3、家鼠和野鼠血清樣本乙腦病毒抗體的檢測采用間接ELISA檢測鼠血清樣本乙腦病毒IgG抗體,將陽性樣本用病毒中和實驗測定中和抗體滴度,然后,用間接ELISA檢測鼠血清樣本登革病毒IgG抗體,排除登革感染。4、乙腦病毒感染NIH小鼠模型的建立4.1病毒株：本研究使用的2株乙腦病毒株均屬于GⅢ型,GD乙腦病毒株于2009年廣東地區(qū)的大足鼠耳蝠腦組織中分離、鑒定并保存,NAK株(Nakayama株,中山株)乙腦病毒是首次從日本乙腦病人體內(nèi)分離的乙腦病毒株,由本實驗室保存。病毒株通過顱內(nèi)接種3日齡乳鼠進行病毒擴增,將病毒過濾液感染BHK-21細胞,制成病毒液,并測定TCID50.4.2乙腦病毒株半數(shù)致死量測定：分為2個病毒株組(NAK組和GD組),每個組分為6個劑量小組(10～105 TCID50/100μL),每個劑量小組有6只NIH小鼠,雌雄各半,5-6周齡,共用72只小鼠。設立1個對照組,共6只小鼠。將原病毒液稀釋成10～105TCID5o/100μL6個濃度梯度。采用腹腔注射的方式,按不同的濃度梯度分組,每只小鼠100gL。對照組給予每只小鼠100μL PBS溶液。注射乙腦病毒后,共觀察21天。將發(fā)病死亡的小鼠無菌解剖,取腦組織進行乙腦病毒檢測。將不發(fā)病小鼠在感染病毒后21天眼球取血、處死,檢測血清乙腦病毒中和抗體。4.3乙腦病毒感染小鼠：分為2個病毒株組(NAK組和GD組),每個病毒株組有30只小鼠,雌性,5-6周齡,共用60只小鼠。設立1個對照組,共15只小鼠。(1)初次感染：采用腹腔注射的方式,按不同的病毒株組,給予每只小鼠乙腦病毒毒力為103TCID50/100μL.對照組給予每只小鼠100μL PBS溶液。病毒組分別在感染后4、7、8、10、11、12、13、14、17d剖殺1-3只小鼠,對照組在相同的時間剖殺1只小鼠,下頜下取血后處死,并分離出上層血清。無菌解剖后取腦、肝、脾樣本。檢測小鼠血液、腦、肝、脾乙腦病毒的檢測,檢測小鼠血清乙腦病毒中和抗體。(2)再次感染：初次感染35d后,將存活的小鼠進行再次感染,NAK組、GD組注射病毒毒力和劑量如前,對照組腹腔注射NAK株乙腦病毒,103TCID50/100μL,100μL。再次感染后,觀察小鼠的死亡情況,分別在再次感染后7、14、21d下頜下取約500ul血液。再次感染21d取血后,處死全部小鼠。檢測小鼠血清乙腦病毒中和抗體。4、質(zhì)量控制(1)移液槍頭、凍存管、EP管等實驗耗材均為一次性用品；(2)RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄所用的容器和試劑如移液槍頭、EP管等,均事先進行DEPC水處理,防止環(huán)境中RNA酶的污染；(3)細胞培養(yǎng)的所有操作均在細胞培養(yǎng)間的超凈臺內(nèi)進行,防止污染；(4)鼠的解剖在無菌間生物安全柜進行,全程戴帽子、口罩和手套,做好個人防護工作；(5)實驗過程嚴格設立陰、陽性對照及空白對照；(6)鼠的血清采集和保存應嚴防細菌污染。研究結果1、家鼠和野鼠樣本采集的基本情況本次研究在廣州市和廈門市部分地區(qū)共采集了198只鼠,包括褐家鼠(Rattus norvegicus)159只,黃毛鼠(Rattus lossea Swinhoe)27只,黃胸鼠(Rattus flavipectus)10只,小家鼠(Mus musculus Linnaeus)2只。共獲188份鼠腦組織樣本,96份鼠血清樣本。2、家鼠和野鼠腦組織樣本乙腦病毒的檢測采用熒光定量RT-PCR和普通RT-PCR對188份腦組織樣本進行乙腦病毒的檢測,結果均為陰性。3、家鼠和野鼠血清樣本乙腦病毒抗體的檢測對采集的96份鼠血清樣本進行乙腦病毒IgG抗體檢測,結果顯示45.8%(44/96)血清樣本為陽性。廣州市和廈門市鼠乙腦病毒IgG抗體檢測率分別為44.1%(15/34),46.0%(29/62)。對上述乙腦病毒IgG抗體陽性的44份血清樣本進行乙腦病毒中和抗體滴度測定,由于有8份樣本血清量不足,只對36份樣本進行了病毒中和試驗。試驗結果顯示,61.5%(24/39)血清樣本為乙腦病毒中和抗體陽性(抗體滴度≥1：1O),中和抗體滴度為1：10-56。對上述乙腦病毒IgG抗體陽性的44份血清樣本進行登革病毒IgG抗體,ELISA結果顯示,這些血清樣本均未登革病毒IgG抗體,可排除登革病毒的感染。4、乙腦病毒感染NIH小鼠模型的建立4.1小鼠感染乙腦病毒后的癥狀：NAK株病毒組中,小鼠初次感染乙腦病毒8d后,開始發(fā)病,出現(xiàn)弓背后肢癱瘓、震顫、行動遲緩、眼眶出血等癥狀,感染14d后,剩余的小鼠沒有發(fā)生發(fā)病或死亡。GD株病毒組中,小鼠初次感染乙腦病毒7d后,開始發(fā)病,出現(xiàn)上述類似的癥狀。對照組中,沒有小鼠死亡。4.2乙腦病毒株半數(shù)致死量實驗的結果：NAK株病毒組中,10～105TCID5o/100μL小組小鼠死亡的數(shù)量分別為3、1、4、1、3、5，，GD株病毒組中分別為0、2、4、5、1、5。由于各劑量小組小鼠死亡數(shù)量沒有規(guī)律,無法計算乙腦病毒株的半數(shù)致死量。2個病毒株組中,小鼠血清中和抗體平均滴度隨著病毒毒力的上升而升高。本研究選定103TCID50/100μL作為乙腦病毒感染小鼠實驗的毒力濃度。4.3小鼠初次感染乙腦病毒結果：(1)小鼠血清樣本中乙腦病毒檢測結果：NAK病毒株組,感染后8d、10d、11d小鼠血清為乙腦病毒陽性,病毒載量為3.8×101-1.6×104 copies/mL. GD病毒株組,可在感染后4d、7d、10d、lid、14d小鼠血清檢測出乙腦病毒陽性,病毒載量為0.7-9.8×102copies/mL.(2)小鼠腦組織樣本中乙腦病毒檢測結果：NAK病毒株組,感染后4d、7d、8d、10d、11d、14d小鼠腦組織標本中檢測出乙腦病毒陽性,病毒載量為7.25×105～1.70×109copies/mL. GD病毒株組,可在感染后4d、7d、8d、10d、11d小鼠腦組織標本中檢測出乙腦病毒陽性,病毒載量為6.7～7.4×108copies/mL.(3)小鼠脾組織樣本中乙腦病毒檢測結果：NAK病毒株組,運用熒光定量在感染后4d、1ld小鼠脾臟組織中檢測出乙腦病毒陽性,病毒載量為2.2～13.5copies/mL. GD病毒株組,可在感染后4d、8d、10d小鼠脾臟組織中檢測出乙腦病毒陽性,病毒載量為0.3～84.9 copies/mL.(4)小鼠肝組織樣本中乙腦病毒檢測結果：NAK病毒株組,GD病毒株組,對照組未在小鼠肝臟樣本檢測出乙腦病毒。(5)小鼠血清乙腦病毒中和抗體檢測結果：小鼠初次感染乙腦病毒后,NAK、GD病毒株組乙腦病毒中和抗體滴度隨時間的變化呈上升的趨勢,NAK病毒株組從lOd開始,血清乙腦病毒中和抗體滴度大于1：20,GD病毒株組從11d開始,中和抗體大于1：20,而對照組小鼠的中和抗體均未檢出。4.4小鼠再次感染血清乙腦病毒結果(1)小鼠死亡情況觀察：對照組注射乙腦病毒8d后,開始有小鼠發(fā)病死亡,癥狀如前,觀察結束后,對照組有3只小鼠存活。NAK組、GD組未見小鼠發(fā)病死亡。(2)小鼠再次感染后血清乙腦病毒中和抗體檢測：小鼠再次感染乙腦病毒后,NAK組和GD組在感染后7d抗體滴度均大于1：300,中和抗體滴度隨時間的變化,呈下降的趨勢。對照組感染乙腦病毒14d后,中和抗體滴度大于1：20,中和抗體滴度隨時間的變化,呈下降的趨勢。研究結論1、廣州和廈門地區(qū)家鼠及野鼠鼠腦組織中未分離出乙腦病毒,而血清中攜帶較高的乙腦病毒抗體,提示曾感染乙腦病毒。本研究提示對鼠在乙腦傳播中的作用值得進一步研究。2、小鼠對人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙腦病毒株均易感,并出現(xiàn)與乙腦病人相似的癥狀。小鼠感染人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙腦病毒株后,出現(xiàn)病毒血癥,并存在中和抗體和病毒共存的時期,具備潛在的傳播乙腦病毒的能力。高滴度的中和抗體對小鼠有保護作用,而低滴度中和抗體的效能尚不明確。
【關鍵詞】：乙腦病毒 乙腦病毒抗體 鼠 流行病學調(diào)查 小鼠模型
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R512.32
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 研究背景和研究設想20-29
• 1 研究背景20-27
• 2 研究設想27-29
• 第二章 鼠攜帶乙腦病毒情況的流行病學調(diào)查29-49
• 1 材料29-32
• 2 方法32-44
• 2.1 鼠標本的采集32
• 2.2 鼠腦組織樣本中乙腦病毒的檢測32-39
• 2.3 鼠腦組織樣本中乙腦病毒的分離39-41
• 2.4 鼠血清樣本中乙腦病毒抗體的檢測41-43
• 2.5 質(zhì)量控制43-44
• 3 結果44-49
• 3.1 鼠的來源及種類44-45
• 3.2 鼠標本的采集45
• 3.3 鼠腦組織樣本中乙腦病毒的檢測45-47
• 3.4 鼠血清樣本中乙腦病毒抗體的檢測47-49
• 第三章 NIH小鼠感染乙腦病毒模型初步探究49-62
• 1 材料49
• 2 方法49-52
• 2.1 病毒株49-50
• 2.2 乙腦病毒半數(shù)致死量測定50-51
• 2.3 乙腦病毒感染小鼠51-52
• 3 結果52-62
• 3.1 乙腦病毒半數(shù)致死量測定52-54
• 3.2 小鼠乙腦病毒模型構建54-62
• 第四章 討論62-66
• 本研究的創(chuàng)新點和不足66-67
• 研究結論67-68
• 附錄縮略詞匯表68-70
• 參考文獻70-79
• 碩士期間完成和發(fā)表論文情況79-80
• 致謝80-81

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