本文關(guān)鍵詞：血液及淋巴系疾病論文，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
免疫球蛋白輕鏈克隆性重排分析在B
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本站編輯：admin 日期： 2010-08-12 18:53 點擊：次
【中文摘要】:
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【中文摘要】淋巴瘤由于其分類復(fù)雜，對其診斷主要依賴形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方法，Southern blot也曾成為診斷淋巴瘤的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是都有其缺陷，形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)雖然能有助于正確的診斷和分類，但是仍然有一部分病例不能得到確診，Southern blot借助分子病理學(xué)的方法對淋巴瘤進(jìn)行診斷特異性和敏感性較高，但是由于其存在以下局限性，如費(fèi)時，要求的DNA質(zhì)量較高(10-20μg)，不適于在臨床常規(guī)推廣開展。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)快捷，方便，用于淋巴瘤的診斷受到人們的關(guān)注。Southern blot和PCR檢測淋巴瘤的理論依據(jù)在于：腫瘤的所有細(xì)胞均來源一個克隆(clone)，理論認(rèn)為正常發(fā)育的B細(xì)胞和T細(xì)胞分別經(jīng)過免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)基因重排和T細(xì)胞受體重排(T cell receptor, TCR)。淋巴組織良性增生性疾病中表現(xiàn)為Ig基因和(或)TCR基因多克隆重排。而腫瘤細(xì)胞起源于一個克隆，在淋巴瘤中就表現(xiàn)為Ig基因或者TCR基因單克隆重排。PCR檢測淋巴瘤的克隆性正式檢測淋巴瘤的Ig基因重排和TCR基因重排。目前淋巴瘤的分子病理診斷在臨床實踐中存在以下幾方面問題：首先，以往研究Ig基因克隆性重排主要集中在重鏈(heavy chain)可變區(qū)基因，之所以IgH成為檢測的首選目標(biāo)，主要的原因是大多數(shù)的B細(xì)胞腫瘤有IgH基因重排，IgH基因重排發(fā)生在IgL基因重排之前，一些B細(xì)胞惡性腫瘤尤其是一些前體淋巴母細(xì)胞白血病和淋巴瘤部分沒有進(jìn)行IgL基因重排。第二方面，目前，世界范圍內(nèi)在應(yīng)用IgH重排檢測淋巴瘤時還有不少困難，如假陽性、假陰性、雙克隆以及寡克隆的意義等問題。世界各國還在尋找各種方案解決這些問題，其中BIOMED-2方案的出現(xiàn)就是其中之一，BIOMED-2方案是歐洲7個國家的47個研究所合作產(chǎn)生的一個關(guān)于淋巴瘤分子病理診斷的方案。該方案的產(chǎn)生旨在對淋巴瘤分子病理診斷方案的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，但是目前的方案體系太復(fù)雜，一個PCR反應(yīng)體系需要多條引物，如IgH PCR的反應(yīng)體系多大21條引物之多，根據(jù)該方案的設(shè)計，完成一例淋巴瘤檢測成本會很高。鑒于此，這個方案目前還在改進(jìn)、簡化和探索中。值得注意的是，多年來人們都依據(jù)IgH來進(jìn)行克隆性檢測，而在應(yīng)用IgL方面，臨床實踐和研究均不多。理論上認(rèn)為輕鏈由于其CDRs區(qū)的體細(xì)胞超突變可能低于重鏈CDRs區(qū)。目前關(guān)于輕鏈克隆性重排研究的資料積累有限，但是理論上和已經(jīng)發(fā)表的一些研究成果可知在淋巴瘤中對輕鏈的研究在一定程度上能夠輔助重鏈克隆性重排檢測。因而我們依據(jù)我們多年的工作基礎(chǔ)和實驗室現(xiàn)有條件，對IgL在淋巴瘤分子病理診斷中的作用作初步的研究，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。第三方面，目前現(xiàn)有研究表明，IgH基因克隆性重排檢測與淋巴瘤的起源有緊密的聯(lián)系。來源于幼稚淋巴細(xì)胞，也稱為生發(fā)中心前(pregerminal centre, pre-GC)幼稚B細(xì)胞的腫瘤，通常表達(dá)未突變的IgH可變區(qū)(VH)基因，顯示有高的IgH克隆性重排檢測率，而另一些來源于記憶性B細(xì)胞，在生發(fā)中心(germinal center, GC)發(fā)生的的腫瘤細(xì)胞通常有體細(xì)胞超突變的VH基因(GC和post-GC記憶B細(xì)胞)，顯示有較低的克隆性重排檢測率。Ig基因的CDRs體細(xì)胞超突變允許抗體和靶抗原親合力成熟而導(dǎo)致B細(xì)胞選擇。這些體細(xì)胞突變也會發(fā)生在FR，F(xiàn)R區(qū)是大多數(shù)通用和家族引物設(shè)計區(qū)。突變得最終結(jié)果就是導(dǎo)致一致靶序列丟失還有靶位點的改變，該改變會影響引物得最佳匹配。通用性引物和家族性引物的總體上來講對相當(dāng)一部分的基因是最適的，但是對其它一部分基因也顯示了較低的同源性。第四方面，早期報道的淋巴瘤基因檢測中存在雙重重排的現(xiàn)象，當(dāng)前的觀點認(rèn)為免疫表型為B細(xì)胞或者T細(xì)胞的淋巴瘤同時發(fā)生IgH基因及TCR基因的克隆性重排稱為雙重重排(dual rearrangements)。同時也有研究報道免疫表型為B細(xì)胞的淋巴瘤同時發(fā)生IgH兩個等位基因的克隆性重排稱為雙克隆重排(biclonal rearrangement)；T細(xì)胞中發(fā)生兩個等位基因的克隆性重排也稱為雙克隆重排。本文中所涉及的雙重重排現(xiàn)象指同時發(fā)生IgH基因和TCR基因的克隆性重排�？寺⌒噪p重重排的現(xiàn)象逐漸受到關(guān)注，PCR檢測到的雙重重排的淋巴瘤是否真正發(fā)生了雙重重排?其臨床預(yù)后同一般發(fā)生重排的淋巴瘤有何不同?其發(fā)生機(jī)制又是怎樣?依據(jù)重排機(jī)制，B-NHL先發(fā)生IgH重排，重排成功發(fā)生Igκ重排，而后發(fā)生Igλ重排，對于雙重重排研究引入輕鏈重排的概念，可以初步嘗試揭示PCR檢測到的雙重重排是否真正發(fā)生了雙重重排，及對雙重重排的發(fā)生機(jī)制做一些初步的探討。鑒于以上資料，本研究首先采用PCR方法，聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物，檢測77例B-NHL的IgH基因及TCRγ基因克隆性重排，測定IgH基因克隆性重排在本實驗室B-NHL中的檢測率，研究IgLPCR在B-NHL中的應(yīng)用，同時選出雙重重排的病例進(jìn)一步通過DNA測序技術(shù)和輕鏈基因克隆性重排研究雙重重排的現(xiàn)象。材料與方法1材料(1) NHL標(biāo)本：收集1997-2007年我醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的B-NHL標(biāo)本77例，全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片，除常規(guī)HE染色外，采用LCA(2B11，DAKO)、CD3(F7.2.38，DAKO)，CD45RO(OPD4，DAKO)、CD20(L26，DAKO)免疫組化S-P法標(biāo)記淋巴細(xì)胞亞群，根據(jù)腫瘤的免疫表型，，確定為B-NHL，按照2000年WHO關(guān)于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對所有病例進(jìn)行分類，kappa light chain(L1C1, DAKO)和lambda light chain(LAM03+HP6054, DAKO)標(biāo)記輕鏈。(2)對照組標(biāo)本：收集反應(yīng)性淋巴結(jié)炎石蠟標(biāo)本2例。2方法(1)經(jīng)典蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蠟組織DNA。(2)采用PCR方法，聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物，檢測77例NHL標(biāo)本IgH基因及TCRγ基因克隆性重排，產(chǎn)物先2％瓊脂糖電泳初篩，后行8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。(3)采用PCR方法，檢測IgL基因克隆性重排，包括Igr基因克隆性重排和Igλ基因克隆性重排，產(chǎn)物先經(jīng)2％瓊脂糖電泳初篩，后行8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析�？寺y序分析。結(jié)果1．采用FR3A引物，克隆性IgH基因重排在77例B-NHL中檢測率為62.3％(48／77)，聯(lián)合FR3A、FR2A引物，總檢測率為75.3％(58／77)。2．聯(lián)合FR3A、FR2A及TCR_γ引物，6.5％(5／77)NHL初步檢測到發(fā)生雙重重排。免疫組化結(jié)果提示這5例均為B細(xì)胞表型。病理類型分別為2例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、2例MALT-MZL及1例濾泡性淋巴瘤(FL)。3．克隆性Igκ基因重排在77例B-NHL中檢測率為11.7％(9／77)，克隆性Igλ基因重排檢測率為6.5％(5／77)，聯(lián)合IgL基因重排，克隆性基因重排在77例B-NHL中檢測率是18.2％(14／77)。結(jié)論1．采用FR3A引物，克隆性IgH基因重排在B-NHL中檢測率為62.3％，聯(lián)合FR3A、FR2A引物，可提高檢測率到75.3％。2．Igκ基因重排克隆性分析檢測率11.7％，Igλ基因重排克隆性分析檢測率6.5％，克隆性IgH基因重排檢測率是18.2％，聯(lián)合應(yīng)用IgH和IgL基因克隆性分析能夠提高檢測率(從75.3％到84.5％)�？寺⌒訧gL基因重排能提高淋巴瘤的檢測率。3．雙重重排現(xiàn)象在我們實驗室惡性淋巴瘤中的初步檢測率為6.5％。病理類型集中在DLBCL、MALT-MZL、FL。4．對高度懷疑為淋巴瘤的臨床病理標(biāo)本進(jìn)行克隆性重排檢測時，必須對同一樣本同時檢測IgH和TCR基因，才能保證結(jié)果的完整性和真實性，兩者缺一不可。
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