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應(yīng)用CpG
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本站編輯：admin 日期： 2010-08-12 18:36 點(diǎn)擊：次
【中文摘要】:
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【中文摘要】研究背景慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)是一種起源于終末期成熟B淋巴細(xì)胞的克隆性惡性血液病。其白血病細(xì)胞有絲分裂活性低下,加用植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA )培養(yǎng)由于主要刺激T細(xì)胞分裂,結(jié)果大多為正常核型;加用多克隆B細(xì)胞激活劑(polyclonal activator)培養(yǎng),大約半數(shù)CLL可檢出克隆性染色體異常。20世紀(jì)90年代以來(lái)采用多種探針的組合熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)使CLL的染色體異常檢出率提高至80%。最近幾年德國(guó)學(xué)者將未甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotide, CpG-ODN)作為免疫刺激劑用于CLL的細(xì)胞遺傳學(xué)研究,結(jié)果明顯提高了異常核型的檢出率,特別是檢出了預(yù)后差的各種易位。目的為了證實(shí)CpG-ODN刺激法是否能提高我國(guó)CLL核型異常檢出率,我們對(duì)57例CLL患者進(jìn)行了臨床和實(shí)驗(yàn)研究。方法抽取患者骨髓或外周血,應(yīng)用CpG-ODN和白細(xì)胞介素-2(interlekin-2, IL-2)共刺激培養(yǎng)其白血病細(xì)胞,同時(shí)分別應(yīng)用PHA、美洲商陸(pokeweed mitogen, PWM)和IL-2進(jìn)行刺激培養(yǎng),然后采用R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。應(yīng)用SAS(statistical analysis system)統(tǒng)計(jì)學(xué)程序?qū)?組異常核型檢出率作了比較。應(yīng)用Cen-12、D13S25(13q14.3)、Rb1(13q14)、ATM(11q22.3)、P53(17p13.1)、MYB(6q23)和IgH重排(14q32)等探針對(duì)19例核型正常患者的直接法標(biāo)本進(jìn)行組合FISH檢測(cè)。此外,抽提患者DNA,使用IgVH(immunoglobulin variable heavy chain)基因重排特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,以判斷該基因是否發(fā)生突變及突變位置。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD38和ZAP70表達(dá)。隨訪患者并對(duì)四組核型異常檢出率以及核型和其它各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)之間的聯(lián)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果(1)四組免疫刺激劑培養(yǎng)CLL細(xì)胞的常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析(conventional cytogenetics, CC)結(jié)果顯示:以DSP30+IL-2作為免疫刺激劑培養(yǎng)57例CLL細(xì)胞,其中25例(43.85%)患者顯示核型異常,平均異常細(xì)胞百分比為72.98%,畸變種類共52種;以PHA作為免疫刺激劑培養(yǎng)53例CLL細(xì)胞,其中8例(15.09%)患者顯示核型異常,平均異常細(xì)胞百分比為6.25%;以PWM作為免疫刺激劑培養(yǎng)52例CLL細(xì)胞,其中9例(17.31%)患者顯示核型異常,平均異常細(xì)胞百分比為7.22%;以IL-2作為免疫刺激劑培養(yǎng)40例CLL細(xì)胞,其中僅1例(3.13%)患者顯示核型異常。運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)程序?qū)SP30+IL-2組和PHA組、PWM組、IL-2組刺激培養(yǎng)CLL細(xì)胞后核型異常檢出率進(jìn)行比較,結(jié)果顯示DSP30+IL-2組核型異常檢出率明顯高于PHA組、PWM組和IL-2組,P值均<0.0001。DSP30+IL-2組核型異常中數(shù)目增加以單純+12或伴有+12的異常為最多,共9例次;染色體結(jié)構(gòu)重排共40種,其中以易位為最多見,共14例,包括平衡易位11例(78.5%)和不平衡易位3例(21.43%)。在平衡易位中又以14q32重排為最多見,包括t(14;18)(q32;q21)3例,t(14;19)(q32;q13)2例,t(11;14)(q13;q32)和t(11;14)(q23;q32)各1例。其它染色體結(jié)構(gòu)重排還包括倒位、重復(fù)、等臂染色體和標(biāo)記染色體等。染色體部分缺失包括1q-、2p-、3p-、6p-、6q-、9q-、11q-、13q-和15q-等多種類型,其中6q- 3例,11q-和13q-各2例。復(fù)雜異常共9例。DSP30+IL-2組檢出的異常分別在8例PHA刺激組、9例PWM刺激組和1例IL-2刺激組中得到證實(shí),且陽(yáng)性細(xì)胞大多為1個(gè)。(2)19例正常核型的CLL患者采用一組探針進(jìn)行FISH檢測(cè),結(jié)果顯示三體-12 1例;13q14.3缺失11例;Rb1基因缺失6例且均伴有13q14.3缺失;ATM缺失陰性;P53基因缺失僅1例;MYB缺失陰性;IgH基因重排1例和IgH部分缺失1例。綜上所述,該組患者中13例(68.42%)有一種或一種以上FISH異常。(3)21例患者的IgVH基因經(jīng)擴(kuò)增、電泳和凝膠成像后18例患者顯示235-254bp的單克隆條帶。PCR(polymerase chain reaction)產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序和IMGT/V-QUEST工具分析顯示18例患者中有10例發(fā)生突變(55.55%),8例患者未發(fā)生突變(44.44%),平均突變率為5.88%,突變主要發(fā)生在VH3、VH1和VH4等區(qū)域。10例IgVH突變患者中3例(30%)有核型異常,而8例無(wú)IgVH突變患者中6例(75%)有核型異常,且其中3例為復(fù)雜異常。但統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差別無(wú)顯著性(P>0.05)。(4)45例流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD38表達(dá)的患者中10例(22.22%)為CD38+,35例(77.78%)為CD38-,27例檢測(cè)ZAP70表達(dá)的患者中11例(40.74%)為ZAP70+,其余16例(59.25%)為ZAP70-。26例同時(shí)進(jìn)行CD38和ZAP70的檢測(cè),其中5例(19.23%)患者示CD38+ZAP70+,13例(50%)顯示CD38-ZAP70-,2例(7.69%)顯示CD38+ZAP70-,6例(23.08%)顯示CD38-ZAP70+。CD38+的10例中5例(50%)有異常核型,而CD38-的35例中14例(40%)有異常核型。11例ZAP70+患者中4例(36.36%)有異常核型,而ZAP70-的16例中8例(50%)有異常核型。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)CD38、ZAP70表達(dá)和核型有聯(lián)系。結(jié)論①CpG-ODN刺激法是一種簡(jiǎn)易而有效的刺激CLL中期分裂相產(chǎn)生的方法,可明顯提高異常核型的檢出率;②CpG-ODN刺激CLL白血病細(xì)胞能明顯提高各種平衡和不平衡易位的檢出率;③FISH和常規(guī)核型分析是互相補(bǔ)充的,兩者結(jié)合能為CLL患者提供更全面的遺傳學(xué)信息。
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