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淋巴瘤屬于血液病嗎_血液淋巴細(xì)胞偏低_shRNA表達(dá)載體沉默Bcl

發(fā)布時(shí)間：2016-07-08 08:16

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    【中文摘要】目的: B細(xì)胞淋巴瘤與抗凋亡基因Bcl-2的過(guò)表達(dá)密切相關(guān),調(diào)低該基因的表達(dá)將有助恢復(fù)細(xì)胞凋亡功能,逆轉(zhuǎn)腫瘤形成。RNA干擾(RNAi)能高效特異地調(diào)低基因表達(dá),已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究。本課題通過(guò)構(gòu)建Bcl-2 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞,體內(nèi)、外觀察shRNA表達(dá)載體對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)的影響,以及對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,為進(jìn)一步研究B細(xì)胞淋巴瘤的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:○1軟件分析Bcl-2 mRNA結(jié)構(gòu)以篩選出擬干擾靶位點(diǎn),構(gòu)建Bcl-2 shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009,同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照重組質(zhì)粒pGenesil-1-NC,經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定后,提取各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞;○2實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pGenesil-1-Bcl-2-544組、pGenesil-1-Bcl-2-1009組和pGenesil-1-NC組進(jìn)行體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)�！�3在48h時(shí)測(cè)定細(xì)胞凋亡和Bcl-2 mRNA相對(duì)含量,以觀察各干擾重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞后對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的抑制作用;○4 G418篩選獲得各重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞,RT-PCR、FCM、Western-blotting測(cè)定Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá),細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞增殖能力;○5各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞接種BALB/c裸鼠,建立B細(xì)胞淋巴瘤荷瘤裸鼠模型;通過(guò)觀測(cè)成瘤時(shí)間、瘤體積和瘤重量,免疫組化測(cè)定Bcl-2蛋白表達(dá),透射電鏡觀察瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),研究Bcl-2 shRNA對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果:○1測(cè)序和酶切鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544、pGenesil-1-Bcl-2-1009和pGenesil-1-NC均成功構(gòu)建;○2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h時(shí),pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組的凋亡指數(shù)分別是空白對(duì)照組的4.70和3.78倍(p<0.05),對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)的抑制率分別為31.91%和47.61%(與對(duì)照組相比,p<0.05);○3 G418成功篩選出各重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Raji細(xì)胞,FCM測(cè)得各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分率均達(dá)97%以上;pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2mRNA的抑制率分別為72.71%和45.50%,與對(duì)照組相比差異具有顯著性意義(p<0.05);FCM測(cè)得Bcl-2蛋白抑制率分別為73.37%和59.67%(與對(duì)照組相比,p<0.05),Western-blotting結(jié)果與FCM結(jié)果基本相符;對(duì)各組細(xì)胞增殖速度的比較表明,兩干擾組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力明顯下降;○4 pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組移植瘤的平均成瘤時(shí)間明顯延遲,平均瘤體積、重量明顯下降,切片的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)兩干擾組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào),透射電鏡顯示兩干擾組瘤細(xì)胞有一定比例的凋亡;○5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:pGenesil-1-Bcl-2-544組對(duì)Bcl-2基因的干擾作用較pGenesil-1-Bcl-2-1009組明顯,抑制瘤細(xì)胞的增殖也更明顯;而pGenesil-1-NC對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2基因無(wú)明顯干擾作用,對(duì)瘤細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。結(jié)論:成功構(gòu)建Bcl-2 shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009;兩干擾重組質(zhì)粒能在體內(nèi)、外干擾Raji細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá),抑制B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖;5’-GTACATCCATTATAAGCTG-3’和5’-CATCGCCCTGTGGATGACT-3’可作為B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞Bcl-2基因的RNAi靶點(diǎn)。


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    本文編號(hào)：67097

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