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淋巴瘤屬于血液病嗎_血液淋巴細胞偏低_shRNA表達載體沉默Bcl

發(fā)布時間：2016-07-08 08:16

  本文關(guān)鍵詞：血液及淋巴系疾病論文，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


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    【中文摘要】目的: B細胞淋巴瘤與抗凋亡基因Bcl-2的過表達密切相關(guān),調(diào)低該基因的表達將有助恢復(fù)細胞凋亡功能,逆轉(zhuǎn)腫瘤形成。RNA干擾(RNAi)能高效特異地調(diào)低基因表達,已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究。本課題通過構(gòu)建Bcl-2 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B細胞淋巴瘤Raji細胞,體內(nèi)、外觀察shRNA表達載體對Raji細胞Bcl-2基因表達的影響,以及對Raji細胞生長的抑制作用,為進一步研究B細胞淋巴瘤的基因治療奠定實驗基礎(chǔ)。方法:○1軟件分析Bcl-2 mRNA結(jié)構(gòu)以篩選出擬干擾靶位點,構(gòu)建Bcl-2 shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009,同時構(gòu)建陰性對照重組質(zhì)粒pGenesil-1-NC,經(jīng)測序和酶切鑒定后,提取各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Raji細胞;○2實驗分為空白對照組、pGenesil-1-Bcl-2-544組、pGenesil-1-Bcl-2-1009組和pGenesil-1-NC組進行體內(nèi)、外實驗。○3在48h時測定細胞凋亡和Bcl-2 mRNA相對含量,以觀察各干擾重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Raji細胞后對Bcl-2基因表達的抑制作用;○4 G418篩選獲得各重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細胞,RT-PCR、FCM、Western-blotting測定Bcl-2 mRNA和蛋白的表達,細胞計數(shù)測定細胞增殖能力;○5各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細胞接種BALB/c裸鼠,建立B細胞淋巴瘤荷瘤裸鼠模型;通過觀測成瘤時間、瘤體積和瘤重量,免疫組化測定Bcl-2蛋白表達,透射電鏡觀察瘤細胞超微結(jié)構(gòu),研究Bcl-2 shRNA對B細胞淋巴瘤移植瘤生長的抑制作用。結(jié)果:○1測序和酶切鑒定證實重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544、pGenesil-1-Bcl-2-1009和pGenesil-1-NC均成功構(gòu)建;○2瞬時轉(zhuǎn)染48h時,pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組的凋亡指數(shù)分別是空白對照組的4.70和3.78倍(p<0.05),對Raji細胞Bcl-2基因表達的抑制率分別為31.91%和47.61%(與對照組相比,p<0.05);○3 G418成功篩選出各重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Raji細胞,FCM測得各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞百分率均達97%以上;pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009對Raji細胞Bcl-2mRNA的抑制率分別為72.71%和45.50%,與對照組相比差異具有顯著性意義(p<0.05);FCM測得Bcl-2蛋白抑制率分別為73.37%和59.67%(與對照組相比,p<0.05),Western-blotting結(jié)果與FCM結(jié)果基本相符;對各組細胞增殖速度的比較表明,兩干擾組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖能力明顯下降;○4 pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組移植瘤的平均成瘤時間明顯延遲,平均瘤體積、重量明顯下降,切片的免疫組化結(jié)果進一步證實兩干擾組Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào),透射電鏡顯示兩干擾組瘤細胞有一定比例的凋亡;○5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明:pGenesil-1-Bcl-2-544組對Bcl-2基因的干擾作用較pGenesil-1-Bcl-2-1009組明顯,抑制瘤細胞的增殖也更明顯;而pGenesil-1-NC對Raji細胞Bcl-2基因無明顯干擾作用,對瘤細胞的增殖無明顯影響。結(jié)論:成功構(gòu)建Bcl-2 shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009;兩干擾重組質(zhì)粒能在體內(nèi)、外干擾Raji細胞Bcl-2基因表達,抑制B細胞淋巴瘤Raji細胞增殖;5’-GTACATCCATTATAAGCTG-3’和5’-CATCGCCCTGTGGATGACT-3’可作為B細胞淋巴瘤Raji細胞Bcl-2基因的RNAi靶點。


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    本文編號：67097

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