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嵌合分子VEGI~+
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本站編輯：admin 日期： 2010-08-12 18:38 點擊：次
【中文摘要】:
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【中文摘要】一、目的1.應用分子生物學方法設計并合成新型血管生長抑制劑嵌合分子VEGI~+;構建較為理想的人惡性淋巴瘤裸鼠動物模型。2.以殼聚糖作為藥物載體,將設計合成的VEGI、寡肽、VEGI~+嵌合合分子與其結合,構建出納米復合體,并證明其具有良好的體外穩(wěn)定性及有效的體內抑瘤作用,探討納米嵌合分子VEGI~+對人惡性淋巴瘤的抑制作用。二、方法1.設計特異性引物,通過PCR方法獲得VEGI與寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI~+,將PCR產物克隆至pGEM-T載體中,經酶切及測序鑒定后,與原核表達載體pET30a(+)重組,轉化大腸桿菌BL21并誘導表達,His-Ni~(++)金屬鏊合柱對表達產物純化。采用SDS-PAGE電泳及Western-blot對表達產物進行鑒定。2.以殼聚糖(CS)為藥物載體,采用離子膠聯-高壓勻化工藝制備寡肽-CS納米粒、VEGI-CS納米粒、VEGI~+-CS納米粒,用Micro-BCA法對所制得的納米粒包封率、載藥量進行測定,觀察VEGI~+-CS納米粒體外釋放曲線,對其體外穩(wěn)定性進行初步考察。3.應用人惡性淋巴瘤細胞CA-46株接種于6-8周齡的BALB/c裸鼠背部皮下,接種前每只裸鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg,1/日,共2次。兩周后100%成瘤,成功構建裸鼠移植瘤模型。選用腫瘤大小相近的裸鼠35只,隨機分為7組。在7組裸鼠的瘤體內分別多點注射嵌合分子VEGI~+、單純VEGI、單純寡肽、納米VEGI~+、納米VEGI、納米寡肽及PBS,1/日,治療28天。4.抗腫瘤療效觀察:每日觀察裸鼠的生活狀態(tài),各組裸鼠開始治療后分別于第0、7、14、21、28天用游標卡尺測量經過中心點的腫瘤的最長徑(A)和經過中心點的腫瘤最短徑(B),計算腫瘤體積(V)=A×B~2/2及計算腫瘤生長抑制率,公式為:抑瘤率=(對照組體積或瘤重-治療組體積或瘤重)/對照組體積或瘤重×100%,至第28天時分別計算各組裸鼠死亡率。5.通過病理切片HE染色、免疫組化、瘤內微血管密度檢測等主要手段分別來觀察腫瘤組織的病理變化,初步了解VEGI~+-CS納米粒的體外緩釋特性及對腫瘤新生血管的抑制情況。三、結果1.酶切鑒定及測序結果表明,構建的融合基因VEGI~+與預期結果相符。構建好的表達質粒pET30a-VEGI~+轉化大腸桿菌BL21進行誘導表達,SDS-PAGE蛋白電泳顯示其表達形式以包涵體為主。經過復性和純化,SDS-PAGE電泳及Western-blot結果表明,嵌合蛋白VEGI~+的分子量為23KD左右,純度約90%。2.本實驗所制得的VEGI~+-殼聚糖納米粒,外觀形態(tài)較為圓整,呈單分散均勻分布,粒度分布較窄,平均粒徑在100nm左右。測得三種藥物的包封率、載藥量分別為:寡肽-CS納米粒:包封率(79.4%),載藥量(0.66%);VEGI-CS納米粒:包封率(83.4%);載藥量(10.4%);VEGI~+-CS納米粒:包封率(81.9%),載藥量(0.66%),具有良好的體外穩(wěn)定性。3.建立裸鼠人惡性淋巴瘤動物模型,裸鼠在實驗期間生存狀態(tài)良好,無死亡;七組腫瘤體積隨著時間不斷增長,但VEGI~+-CS-NPs組、VEGI~+組的生長速率明顯減慢,自治療第7天測量,腫瘤體積就明顯小于PBS組,組間體積差異非常顯著(P＜0.01=;VEGI-CS-NPs組、納米寡肽組、VEGI組、寡肽組與PBS組相比腫瘤生長也受到抑制,組間體積差異顯著(P＜0.05,其中納米劑型組比單純藥物組間差異亦有差異。治療28天后,以PBS組作為對照組,VEGI~+-CS-NPs組比VEGI~+組、VEGI-CS-NPs組、VEGI組、納米寡肽組、寡肽組具有更高的腫瘤生長抑制率;而單純寡肽組又比單純VEGI組的效果好。4.常規(guī)HE染色結果顯示VEGI~+-CS-NPs組可見瘤組織變性壞死后的大量結締組織增生,纖維化明顯。免疫組化VEGF/CD34染色顯示VEGI~+-CS-NPs組只有很少的VEGF的表達,微血管密度值為18.3±4.5,與其它各組差異均顯著(P＜0.05)。四、結論1.成功構建了重組表達載體pET30a-VEGI~+,并在大腸桿菌中誘導表達,親和層析純化后獲得純度較高的嵌合蛋白VEGI~+。2.納米嵌合分子VEGI~+較嵌合分子VEGI~+具有緩釋作用,體外穩(wěn)定性好,對淋巴瘤抑制效果明顯。3.納米嵌合分子VEGI~+對惡性淋巴瘤具有明顯的抑制作用,可以作為一種有效的靶向于惡性淋巴瘤血管的治療藥物,具有良好的發(fā)展前景。
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