本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)系腫瘤論文，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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本站編輯：admin 日期： 2010-09-09 20:51 點(diǎn)擊：次
【中文摘要】:
相關(guān)神經(jīng)系腫瘤論文
無花果對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研
水通道蛋白在人腦轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)分析
1.2
氫質(zhì)子磁共振波譜分析在星形細(xì)胞瘤與腦
基因（上皮膜蛋白1）在人腦膠質(zhì)瘤中的
替莫唑胺誘導(dǎo)的人腦膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞系的
神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因Human Neurotrimi
腦膠質(zhì)瘤分次照射生物效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
選擇性環(huán)氧合酶
整合素系列在人腦星形細(xì)胞瘤的表達(dá)特征
腦星形細(xì)胞瘤磁共振擴(kuò)散成像及灌注成像
小干擾RNA抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞VEGF表達(dá)
PTEN與Ki67在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義
低劑量率～（125）I粒子間質(zhì)內(nèi)放療治療
～（125）I籽粒近距離照射對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤
CpG ODN增加人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG
【中文摘要】研究背景及目的腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤之一,約占顱內(nèi)腫瘤的40%～60%,尤其是惡性腦膠質(zhì)瘤,具有遠(yuǎn)處侵襲性,惡性程度高,目前在神經(jīng)外科手術(shù)技術(shù)、影像診斷技術(shù)、放療化療等方面盡管取得了很大的進(jìn)步,但患者臨床治療效果仍不盡人意,治愈率低且易復(fù)發(fā),死亡率高,其主要原因之一是患者自身抗腫瘤免疫功能低下,如何提高患者抗腫瘤免疫機(jī)能是膠質(zhì)瘤治療研究中的主要問題之一。隨著對(duì)腦膠質(zhì)瘤免疫學(xué)特性的深入研究和生物技術(shù)的發(fā)展,探索各種膠質(zhì)瘤主動(dòng)免疫疫苗成為生物免疫治療中關(guān)注的熱點(diǎn)。當(dāng)前,治療性腦膠質(zhì)瘤疫苗主要有以下幾類:一是樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)為基礎(chǔ)的疫苗,二是腫瘤細(xì)胞的瘤苗,三是基于病毒載體的溶瘤疫苗。其中腫瘤細(xì)胞疫苗是目前主要的研究方向。本課題研究的是大鼠白介素-12基因(rIL-12)和人類Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶自殺基因(HSV-TK)共同修飾大鼠膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞構(gòu)建的9L-rIL-12/TK可控性“活”細(xì)胞疫苗。此疫苗細(xì)胞具有較完全的腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá),理論上具有提高免疫調(diào)節(jié)能力,同時(shí)更昔洛韋(GCV)對(duì)該疫苗具有殺傷作用,可以控制活疫苗的增殖,防止疫苗細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)增殖或種植轉(zhuǎn)移,在此殺傷過程中,可進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤抗原的釋放和抗原提呈作用,進(jìn)而達(dá)到持續(xù)提高膠質(zhì)瘤的免疫原性,克服因血腦屏障帶來的免疫逃避,強(qiáng)化誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。關(guān)于本課題提出的可控制性膠質(zhì)瘤疫苗模式,目前在國內(nèi)尚未見類似報(bào)告。本研究通過對(duì)現(xiàn)有9L-rIL12-TK細(xì)胞體外純化抗性篩選,觀察其增殖情況,同時(shí)對(duì)其進(jìn)行GCV殺傷實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證HSV-TK/GCV系統(tǒng)的體外殺傷效應(yīng),在此基礎(chǔ)上進(jìn)行裸鼠皮下細(xì)胞接種,觀察疫苗細(xì)胞的體內(nèi)成瘤情況并對(duì)其進(jìn)行GCV干預(yù),對(duì)比干預(yù)前后活疫苗細(xì)胞成瘤變化,評(píng)估9L-rIL12-TK腦膠質(zhì)瘤基因免疫活細(xì)胞疫苗在體內(nèi)的安全可控性,為后續(xù)免疫研究打下基礎(chǔ)。材料與方法1實(shí)驗(yàn)材料自主構(gòu)建基因修飾細(xì)胞(9L-rIL12-TK、9L-TK),9L大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞;高糖型DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清FCS,含0.2%(m/V)EDTA的消化胰酶,更昔洛韋GCV,四甲基偶氮唑藍(lán)MTT,二甲基亞砜(DMSO),BSD,G418,臺(tái)盤藍(lán),一次性耗材,BABL/C裸鼠(SPF)等。2實(shí)驗(yàn)方法2.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.1.1細(xì)胞增殖觀察抗性篩選細(xì)胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細(xì)胞24孔板培養(yǎng),每日消化一組,計(jì)數(shù)細(xì)胞,連續(xù)5天,觀察細(xì)胞增值穩(wěn)定性;2.1.2細(xì)胞GCV殺傷實(shí)驗(yàn)抗性篩選細(xì)胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細(xì)胞96孔板培養(yǎng),次日更換0、5、10、20、40、80、160μg/ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞生長情況,第4天MTT法測細(xì)胞活力;2.2體內(nèi)細(xì)胞成瘤抑制實(shí)驗(yàn)2.2.1裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)40只裸鼠隨機(jī)分為3組,9L-rIL12-TK、9L-TK及9L組,相應(yīng)細(xì)胞右側(cè)腋下接種,1.2×10~6/只;2.2.2成瘤干預(yù)實(shí)驗(yàn)第7天三組裸鼠每組二次分GEV實(shí)驗(yàn)組及生理鹽水對(duì)照組,次日開始干預(yù),實(shí)驗(yàn)組腹腔給予GEV抑瘤干預(yù),對(duì)照組給予生理鹽水以行對(duì)照;2.2.3觀察途徑定時(shí)測量瘤徑,記錄裸鼠生存時(shí)間,實(shí)驗(yàn)終止時(shí)取相應(yīng)標(biāo)本組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.1 24孔板培養(yǎng)觀察到抗性克隆細(xì)胞呈對(duì)數(shù)穩(wěn)定增殖,細(xì)胞的種類與各時(shí)間點(diǎn)的交互效應(yīng)有顯著性差異(F=4.220,P=00003),不同細(xì)胞生長差異有顯著性意義(F=8.761,P=0.017),不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞有顯著性差異(F=2316.347,P=0.000),其中第4天各細(xì)胞有顯著差異(P=0.005),其余時(shí)間點(diǎn)各細(xì)胞間無顯著差異(P＞0.05);1.2通過含不同濃度的GCV的完全培養(yǎng)基96孔板細(xì)胞培養(yǎng),MTT法檢測細(xì)胞活力,可見含帶TK基因的細(xì)胞活力與GCV的濃度呈負(fù)相關(guān),不同濃度GCV與三種細(xì)胞活力的交互作用有顯著性差異(F=407.699,P=0.000),不同濃度的GCV對(duì)細(xì)胞活力的影響有顯著性差異(F=2830.488,P=0.000),三種細(xì)胞對(duì)GCV敏感性有顯著性差異(F=6807.262,P=0.000),其中,在GCV濃度為10ug/ml時(shí),9L-rIL12-TK及9L-TK細(xì)胞殺傷率分別為62.7%、50.93%,前者較后者敏感,差異顯著(P=0.000),而9L細(xì)胞基本不受影響,在濃度20～160ug/ml時(shí),9L細(xì)胞和9L-TK、9L-rIL12-TK細(xì)胞間有顯著差異(均P=0.000),而9L-rIL12-TK細(xì)胞和9L-TK細(xì)胞間無顯著性差異(均P＞0.05),細(xì)胞基本完全被殺死,9L細(xì)胞僅有少量死亡;2.1疫苗細(xì)胞體內(nèi)成瘤抑制實(shí)驗(yàn)9L-rIL12-TK疫苗細(xì)胞與9L-TK細(xì)胞、9L細(xì)胞接種裸鼠皮下,觀察到所有裸鼠在第7天均有成瘤,成瘤率100%,GCV干預(yù)后,9L-rIL12-TK、9L-TK實(shí)驗(yàn)組裸鼠瘤體積均縮小,其余組瘤體繼續(xù)呈增大趨勢。取干預(yù)前后及實(shí)驗(yàn)后期共四個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較瘤體變化,不同時(shí)間點(diǎn)與不同組間裸鼠腫瘤體積增長的交互作用有顯著性差異(F=47.004,P=0.000),不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積增長有顯著性差異(F=316.600,P=0.000),不同組間裸鼠腫瘤體積增長有顯著性差異(F=60.442,P=0.000),其中干預(yù)開始即第9天不同組間腫瘤體積(200.025±38.46mm~3)無顯著性差異(P=0.476),干預(yù)結(jié)束后即第18(273.61±256.47mm~3)、27(1078.21±1287.79mm~3)、36(4350.16±4289.69mm~3)天時(shí),9L-rIL12-TK+GCV組和9L-rIL12-TK組比較差異均顯著(P=0.003、0.002、0.001),9L-TK+GCV組與9L-TK組差異也均顯著(P=0.004、0.001、0.006),9L實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較差異不顯著(P＞0.05),干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)9L-rIL12-TK+GCV組和9L-TK+GCV組間無顯著性差異(P＞0.05),裸鼠瘤體呈消退趨勢,其9L-rIL12-TK+GCV組治療后細(xì)胞生長受控(抑瘤率97.26%)較9L-TK+GCV組(抑瘤率82.52%)明顯,而9L組與9L+GCV組則無顯著差異(P＞0.05),瘤體隨時(shí)間呈增大趨勢。60天時(shí),腫瘤完全消退9L-rIL12-TK+GCV組有8只,復(fù)發(fā)率為0%,9L-TK+GCV組有3只腫瘤完全消退,5只縮小后再次增大,復(fù)發(fā)率62.5%。荷瘤裸鼠生存時(shí)間均受影響,9L+GCV組與9L組間無顯著性差異(LogRankX~2=0.392,P=0.531),而9L-rIL12-TK、9L-TK實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)對(duì)照組間均有顯著差異(LogRankX~2=15.782,LogRankX~2=15.665,均P=0.000),裸鼠腫瘤消退或生長減慢,動(dòng)物生存時(shí)間延長,尤其9L-rIL12-TK實(shí)驗(yàn)組裸鼠完全無瘤生存。2.2裸鼠無瘤接種部位、瘤體及全身相關(guān)臟器取材,大體觀察,含帶rIL-12基因細(xì)胞的裸鼠脾臟顯著增大,9L-TK實(shí)驗(yàn)組后期瘤結(jié)節(jié)中有大量液化壞死;組織學(xué)(蘇木精-伊紅染色HE)鏡下檢查,無瘤接種部位無發(fā)現(xiàn)異性腫瘤細(xì)胞,瘤體中異型性細(xì)胞明顯,不含帶rIL-12基因的細(xì)胞瘤結(jié)節(jié)中血管豐富,而帶rIL-12基因的裸鼠脾臟淋巴細(xì)胞增多;所有裸鼠全身臟器病理學(xué)檢查均未見腫瘤遠(yuǎn)處組織學(xué)轉(zhuǎn)移征象。實(shí)驗(yàn)結(jié)論(1)基因修飾后的9L-rIL12-TK細(xì)胞體外增殖穩(wěn)定,對(duì)GCV殺傷效應(yīng)敏感,表明TK基因在疫苗細(xì)胞內(nèi)是穩(wěn)定表達(dá);(2) 9L-rIL12-TK細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)可成瘤,但能夠被GCV抑制消除;(3) 9L-rIL12-TK細(xì)胞與9L-TK細(xì)胞均在裸鼠體內(nèi)成瘤,但GCV的抑瘤效果9L-rIL12-TK實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于9L-TK實(shí)驗(yàn)組,表明rIL-12參與調(diào)節(jié),從而提高消瘤效果;(4) 9L-rIL12-TK組裸鼠脾臟顯著增大,組織學(xué)檢查淋巴細(xì)胞增多,提示rIL-12可能參與調(diào)節(jié)體液免疫,其機(jī)理有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究;(5) 9L-rIL12-TK細(xì)胞僅在局部成瘤,未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移征象。上述結(jié)論表明,9L-rIL12-TK細(xì)胞疫苗在體內(nèi)外具有較好的增殖活性及安全可控性,其免疫治療效果尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
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