本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)系腫瘤論文，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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本站編輯：admin 日期： 2010-09-09 20:51 點擊：次
【中文摘要】:
相關(guān)神經(jīng)系腫瘤論文
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水通道蛋白在人腦轉(zhuǎn)移瘤中的表達分析
1.2
氫質(zhì)子磁共振波譜分析在星形細胞瘤與腦
基因（上皮膜蛋白1）在人腦膠質(zhì)瘤中的
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神經(jīng)系統(tǒng)特異表達基因Human Neurotrimi
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～（125）I籽粒近距離照射對神經(jīng)膠質(zhì)瘤
CpG ODN增加人腦膠質(zhì)瘤細胞CHG
【中文摘要】研究背景及目的腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤之一,約占顱內(nèi)腫瘤的40%～60%,尤其是惡性腦膠質(zhì)瘤,具有遠處侵襲性,惡性程度高,目前在神經(jīng)外科手術(shù)技術(shù)、影像診斷技術(shù)、放療化療等方面盡管取得了很大的進步,但患者臨床治療效果仍不盡人意,治愈率低且易復發(fā),死亡率高,其主要原因之一是患者自身抗腫瘤免疫功能低下,如何提高患者抗腫瘤免疫機能是膠質(zhì)瘤治療研究中的主要問題之一。隨著對腦膠質(zhì)瘤免疫學特性的深入研究和生物技術(shù)的發(fā)展,探索各種膠質(zhì)瘤主動免疫疫苗成為生物免疫治療中關(guān)注的熱點。當前,治療性腦膠質(zhì)瘤疫苗主要有以下幾類:一是樹突狀細胞(dendritic cell,DC)為基礎的疫苗,二是腫瘤細胞的瘤苗,三是基于病毒載體的溶瘤疫苗。其中腫瘤細胞疫苗是目前主要的研究方向。本課題研究的是大鼠白介素-12基因(rIL-12)和人類Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶自殺基因(HSV-TK)共同修飾大鼠膠質(zhì)瘤9L細胞構(gòu)建的9L-rIL-12/TK可控性“活”細胞疫苗。此疫苗細胞具有較完全的腫瘤細胞抗原表達,理論上具有提高免疫調(diào)節(jié)能力,同時更昔洛韋(GCV)對該疫苗具有殺傷作用,可以控制活疫苗的增殖,防止疫苗細胞在體內(nèi)持續(xù)增殖或種植轉(zhuǎn)移,在此殺傷過程中,可進一步增強腫瘤抗原的釋放和抗原提呈作用,進而達到持續(xù)提高膠質(zhì)瘤的免疫原性,克服因血腦屏障帶來的免疫逃避,強化誘導特異性免疫反應。關(guān)于本課題提出的可控制性膠質(zhì)瘤疫苗模式,目前在國內(nèi)尚未見類似報告。本研究通過對現(xiàn)有9L-rIL12-TK細胞體外純化抗性篩選,觀察其增殖情況,同時對其進行GCV殺傷實驗,驗證HSV-TK/GCV系統(tǒng)的體外殺傷效應,在此基礎上進行裸鼠皮下細胞接種,觀察疫苗細胞的體內(nèi)成瘤情況并對其進行GCV干預,對比干預前后活疫苗細胞成瘤變化,評估9L-rIL12-TK腦膠質(zhì)瘤基因免疫活細胞疫苗在體內(nèi)的安全可控性,為后續(xù)免疫研究打下基礎。材料與方法1實驗材料自主構(gòu)建基因修飾細胞(9L-rIL12-TK、9L-TK),9L大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞;高糖型DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清FCS,含0.2%(m/V)EDTA的消化胰酶,更昔洛韋GCV,四甲基偶氮唑藍MTT,二甲基亞砜(DMSO),BSD,G418,臺盤藍,一次性耗材,BABL/C裸鼠(SPF)等。2實驗方法2.1體外細胞實驗2.1.1細胞增殖觀察抗性篩選細胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細胞24孔板培養(yǎng),每日消化一組,計數(shù)細胞,連續(xù)5天,觀察細胞增值穩(wěn)定性;2.1.2細胞GCV殺傷實驗抗性篩選細胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細胞96孔板培養(yǎng),次日更換0、5、10、20、40、80、160μg/ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每日觀察細胞生長情況,第4天MTT法測細胞活力;2.2體內(nèi)細胞成瘤抑制實驗2.2.1裸鼠成瘤實驗40只裸鼠隨機分為3組,9L-rIL12-TK、9L-TK及9L組,相應細胞右側(cè)腋下接種,1.2×10~6/只;2.2.2成瘤干預實驗第7天三組裸鼠每組二次分GEV實驗組及生理鹽水對照組,次日開始干預,實驗組腹腔給予GEV抑瘤干預,對照組給予生理鹽水以行對照;2.2.3觀察途徑定時測量瘤徑,記錄裸鼠生存時間,實驗終止時取相應標本組織學檢查。實驗結(jié)果1.1 24孔板培養(yǎng)觀察到抗性克隆細胞呈對數(shù)穩(wěn)定增殖,細胞的種類與各時間點的交互效應有顯著性差異(F=4.220,P=00003),不同細胞生長差異有顯著性意義(F=8.761,P=0.017),不同時間點細胞有顯著性差異(F=2316.347,P=0.000),其中第4天各細胞有顯著差異(P=0.005),其余時間點各細胞間無顯著差異(P＞0.05);1.2通過含不同濃度的GCV的完全培養(yǎng)基96孔板細胞培養(yǎng),MTT法檢測細胞活力,可見含帶TK基因的細胞活力與GCV的濃度呈負相關(guān),不同濃度GCV與三種細胞活力的交互作用有顯著性差異(F=407.699,P=0.000),不同濃度的GCV對細胞活力的影響有顯著性差異(F=2830.488,P=0.000),三種細胞對GCV敏感性有顯著性差異(F=6807.262,P=0.000),其中,在GCV濃度為10ug/ml時,9L-rIL12-TK及9L-TK細胞殺傷率分別為62.7%、50.93%,前者較后者敏感,差異顯著(P=0.000),而9L細胞基本不受影響,在濃度20～160ug/ml時,9L細胞和9L-TK、9L-rIL12-TK細胞間有顯著差異(均P=0.000),而9L-rIL12-TK細胞和9L-TK細胞間無顯著性差異(均P＞0.05),細胞基本完全被殺死,9L細胞僅有少量死亡;2.1疫苗細胞體內(nèi)成瘤抑制實驗9L-rIL12-TK疫苗細胞與9L-TK細胞、9L細胞接種裸鼠皮下,觀察到所有裸鼠在第7天均有成瘤,成瘤率100%,GCV干預后,9L-rIL12-TK、9L-TK實驗組裸鼠瘤體積均縮小,其余組瘤體繼續(xù)呈增大趨勢。取干預前后及實驗后期共四個時間點比較瘤體變化,不同時間點與不同組間裸鼠腫瘤體積增長的交互作用有顯著性差異(F=47.004,P=0.000),不同時間點腫瘤體積增長有顯著性差異(F=316.600,P=0.000),不同組間裸鼠腫瘤體積增長有顯著性差異(F=60.442,P=0.000),其中干預開始即第9天不同組間腫瘤體積(200.025±38.46mm~3)無顯著性差異(P=0.476),干預結(jié)束后即第18(273.61±256.47mm~3)、27(1078.21±1287.79mm~3)、36(4350.16±4289.69mm~3)天時,9L-rIL12-TK+GCV組和9L-rIL12-TK組比較差異均顯著(P=0.003、0.002、0.001),9L-TK+GCV組與9L-TK組差異也均顯著(P=0.004、0.001、0.006),9L實驗組和對照組比較差異不顯著(P＞0.05),干預后不同時間點9L-rIL12-TK+GCV組和9L-TK+GCV組間無顯著性差異(P＞0.05),裸鼠瘤體呈消退趨勢,其9L-rIL12-TK+GCV組治療后細胞生長受控(抑瘤率97.26%)較9L-TK+GCV組(抑瘤率82.52%)明顯,而9L組與9L+GCV組則無顯著差異(P＞0.05),瘤體隨時間呈增大趨勢。60天時,腫瘤完全消退9L-rIL12-TK+GCV組有8只,復發(fā)率為0%,9L-TK+GCV組有3只腫瘤完全消退,5只縮小后再次增大,復發(fā)率62.5%。荷瘤裸鼠生存時間均受影響,9L+GCV組與9L組間無顯著性差異(LogRankX~2=0.392,P=0.531),而9L-rIL12-TK、9L-TK實驗組與相應對照組間均有顯著差異(LogRankX~2=15.782,LogRankX~2=15.665,均P=0.000),裸鼠腫瘤消退或生長減慢,動物生存時間延長,尤其9L-rIL12-TK實驗組裸鼠完全無瘤生存。2.2裸鼠無瘤接種部位、瘤體及全身相關(guān)臟器取材,大體觀察,含帶rIL-12基因細胞的裸鼠脾臟顯著增大,9L-TK實驗組后期瘤結(jié)節(jié)中有大量液化壞死;組織學(蘇木精-伊紅染色HE)鏡下檢查,無瘤接種部位無發(fā)現(xiàn)異性腫瘤細胞,瘤體中異型性細胞明顯,不含帶rIL-12基因的細胞瘤結(jié)節(jié)中血管豐富,而帶rIL-12基因的裸鼠脾臟淋巴細胞增多;所有裸鼠全身臟器病理學檢查均未見腫瘤遠處組織學轉(zhuǎn)移征象。實驗結(jié)論(1)基因修飾后的9L-rIL12-TK細胞體外增殖穩(wěn)定,對GCV殺傷效應敏感,表明TK基因在疫苗細胞內(nèi)是穩(wěn)定表達;(2) 9L-rIL12-TK細胞在裸鼠體內(nèi)可成瘤,但能夠被GCV抑制消除;(3) 9L-rIL12-TK細胞與9L-TK細胞均在裸鼠體內(nèi)成瘤,但GCV的抑瘤效果9L-rIL12-TK實驗組明顯優(yōu)于9L-TK實驗組,表明rIL-12參與調(diào)節(jié),從而提高消瘤效果;(4) 9L-rIL12-TK組裸鼠脾臟顯著增大,組織學檢查淋巴細胞增多,提示rIL-12可能參與調(diào)節(jié)體液免疫,其機理有待進一步實驗研究;(5) 9L-rIL12-TK細胞僅在局部成瘤,未見遠處轉(zhuǎn)移征象。上述結(jié)論表明,9L-rIL12-TK細胞疫苗在體內(nèi)外具有較好的增殖活性及安全可控性,其免疫治療效果尚待進一步實驗研究。
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