1 前言

1.1 立題背景
酪蛋白在食品加工中受到越來越多的關注，主要是因為它是全價蛋白質，而且還具有很好的能夠賦予食品優(yōu)良的質構、穩(wěn)定性和加工特性的功能性質，比如：凝膠性、乳化性和起泡性等。酪蛋白的凝膠性和乳化性是模擬干酪工藝成功的關鍵，對干酪的質地和流變學性質有很大的影響。但是隨著食品加工業(yè)的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對食品的要求越來越高，酪蛋白的功能性質已經(jīng)不能完全滿足現(xiàn)代食品加工業(yè)的需要。所以利用物理、化學和酶的方法進一步改善酪蛋白的功能性質成為很多學者研究的熱點。但是在這些改進方法中，例如物理方法對蛋白改性效果不顯著，化學方法因為經(jīng)常使用化學有毒試劑，從而使改性的蛋白存在安全隱患，在食品工業(yè)中不能被大量應用。

糖基化反應成為現(xiàn)在研究的焦點，但是糖基化反應也有不完美的地方，所以研究者們利用生物酶催化糖基化反應，對蛋白進行改性，這方面的研究已經(jīng)有了很大的進展，因為酶促反應具有反應速度比較快，反應需要的條件比較溫和，專業(yè)性強的優(yōu)點，但是其缺點就是選擇合適的酶及如何控制反應條件比較困難，且酶價格相對比較昂貴，最重要的一點就是反應產物的安全性具有爭議。非酶催化糖基化反應就是利用物理方法例如微波加熱、微波波和動態(tài)高壓微射流等催化糖基化反應，這種非酶催化反應容易操作、反應所需要的技術不高，用這樣的方法改性的蛋白質沒有安全隱患，可以放心的應用在食品加工業(yè)中。

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1.2 酪蛋白的性質及研究現(xiàn)狀
1.2.1 酪蛋白的化學組成與結構
1.2.1.1 酪蛋白的化學組成
乳中特有的一種重要的蛋白質就是酪蛋白(casein)簡稱 CN。酪蛋白是從脫脂乳中沉淀所得的一大類蛋白質的總稱，沉淀的條件是：溫度 20℃、等電點 pH 4.6[1]。酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質之一。乳是乳白色的液體，有哺乳動物乳腺分泌的產物，具有很豐富的營養(yǎng)。牛乳中的營養(yǎng)成分主要包括蛋白質、脂肪、維生素、礦物質等，這些營養(yǎng)成分的含量比例和人類對營養(yǎng)的需要很吻合，生物利用率比較高，另外乳中還存在對人和動物生長、免疫有特殊功能的蛋白質，所以牛乳可以作為新生兒的全價哺飼的營養(yǎng)物質。αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和 κ-酪蛋白是組成酪蛋白的成分，這些成分的總和占到牛乳中總蛋白的 76%-86%。另外還有 β-酪蛋白水解產物：γ-酪蛋白和肽，糖基化的 κ-酪蛋白、磷酸化的 αs1 和 αs2-酪蛋白等。這些成分都是有原來的成分通過糖基化、磷酸化和水解衍生而來[2-4]。其性質和組成分別見表 1-1 和表 1-2。
1.2.1.2 酪蛋白的結構
酪蛋白屬于球蛋白，，所以的氨基酸經(jīng)過折疊和螺旋形成比較典型的球蛋白的模式。酪蛋白的疏水性比較強，難溶于水，比大多數(shù)球蛋白的平均值要稍高一些。酪蛋白的氨基酸基團比較活躍，一般在蘇氨酸殘基、絲氨酸殘基上發(fā)生不同程度的磷酸化，這些變化都屬于化學改性[5, 6]。另外，κ-酪蛋白比較活躍，可以發(fā)生糖苷化反應。在酪蛋白的氨基酸結構中，κ-、αs2-半胱氨酸、胱氨酸殘基在二硫鍵和游離巰基的含量變化中發(fā)揮很大作用[7]。 酪蛋白在牛乳中的存在狀態(tài)是膠束形式。酪蛋白膠束有復雜的膠粒組成，這些粒子的大小平均在 0.4μm左右。這些膠粒是特殊的分子聚合物，聚合物含有數(shù)百甚至上千的單個分子，這些分子還包括結合的磷酸鈣、數(shù)量不多的鉀、鈉、鎂，以及檸檬酸鹽。酪蛋白之所以能形成這么復雜的結合體，是因為疏水基、親水基，以及電離化基團，在酪蛋白中大量的存在。

目前，牛乳酪蛋白的一級結構已經(jīng)測定。 1971 年測定了 αs1-酪蛋白的一級結構，含有氨基酸的個數(shù)為 199 個，牛奶中總蛋白含量的 39-46%為 αs1-酪蛋白[8]。αs1-酪蛋白屬于鈣敏性蛋白質，這樣的蛋白質的特征結構是含有可以磷酸化的基團。αs1-酪蛋白中存在 8 個磷酸基，總分子量 23600。αs1-酪蛋白雖然半胱氨酸含量不多，但是脯氨酸含量比較多。αs1-酪蛋白另外一個特點就是一些氨基酸殘基的分布不均勻，尤其是疏水性的、帶電荷的殘基分布，αs1-酪蛋白是一個很獨特的偶極結構，這個結構含有一個具有高度溶劑化的帶電部分，還含有一個具有疏水性的球狀部分。αs2-酪蛋白有 207 個氨基酸組成，分子中還含有磷酸基 10-13個，巰基 2 個，占牛奶總蛋白 8%-11%。僅有兩個區(qū)域相對疏水，即 C 端序列的 160-207 位和 90-120 位，因而 αs2-酪蛋白在酪蛋白中具有最強的親水能力。奶中總蛋白量 25%以上是β-CN， 它占酪蛋白的 22%以上。β-CN 含有的氨基酸殘基數(shù)是 209 個，它結構的 N 端和 C端具有清晰的區(qū)分，N-末端含有帶有負電荷的磷酸絲氨�；�(1-60)，呈酸性和親水性， C-末端是酪蛋白疏水性最強的部位，氨基酸的序列為 141-209，這部分呈堿性和疏水性[9]。因而 4種酪蛋白中最疏水的是 β-酪蛋白。此外 β-酪蛋白可以影響酪蛋白的結構，因為它的結構中有大量的脯氨酸殘基存在，這些殘基可以影響 α-螺旋、β-折疊的結構形成。

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2 材料與方法

2.1 試驗材料
2.1.1 材料與試劑

主要試驗材料及試劑見表 2-1 所示：

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2.2 試驗設計
2.2.1 微波加熱對酪蛋白糖基化反應進程的影響
2.2.1.1 不同功率對酪蛋白糖基化反應的影響
酪蛋白濃度為 6%，溶解在磷酸緩沖液里(0.667 mol/L，pH7.8)，酪蛋白與葡萄糖的比例為 1：1（w/w），反應溶液的量為 300mL，控制溫度 90℃，微波加熱 20min，選擇微波功率100W，300W，500W，700W，900W，檢測接枝度和褐變，研究不同功率微波加熱對酪蛋白糖基化反應程度的影響。
2.2.1.2 不同加熱時間對酪蛋白糖基化反應進程的影響
酪蛋白溶解在 0.667 mol/L 磷酸緩沖液里(pH7.8)，濃度為 6%，蛋白與葡萄糖的比例為 1：1（w/w），反應溶液的量為 300mL，控制溫度 90℃，微波功率 500W，選擇微波加熱 5 min, 15min，20min，25 min，30 min，檢測接枝度和褐變，研究不同微波加熱時間對酪蛋白糖基化反應程度的影響。
2.2.1.3 不同的還原糖對酪蛋白糖基化進程的影響
酪蛋白溶解在磷酸緩沖液里(0.667 mol/L，pH7.8)，濃度為 6%，蛋白與還原糖的比例為 1：1（w/w），反應溶液的量為 300mL，控制溫度 90℃，微波功率 500W，加熱時間 20min，選擇葡萄糖、乳糖、低聚異麥芽糖、β 環(huán)糊精，檢測接枝度和褐變，研究微波加熱條件下不同還原糖對酪蛋白糖基化反應程度的影響。
2.2.2 微波加熱與水浴加熱對酪蛋白糖基化反應的對比研究
2.2.2.1 微波加熱對酪蛋白結構的影響
酪蛋白溶解在磷酸緩沖液里(0.667 mol/L，pH7.8)，濃度為 6%，反應溶液的量為 300mL，控制溫度 90℃，微波功率 500W。與水浴加熱作比較，研究微波加熱對酪蛋白結構的影響。表 2-3 所表示的是各樣品的處理方式。處理以后紫外全波長掃描和熒光光譜分析酪蛋白結構的變化，并分析結果。
2.2.2.2 不同加熱時間下微波與水浴加熱酪蛋白糖基化反應的影響
酪蛋白溶解在 0.667 mol/L 磷酸緩沖液里(pH7.8)，濃度為 6%，蛋白與葡萄糖、β 環(huán)糊精的比例（1：2, 1:3 w/w），反應溶液的量為 300mL，控制溫度 90℃，試驗用的微波功率 500W，與水浴加熱（90℃）做對比，選擇不同的加熱時間 10min，20min，30min，40min，50min，60min。紫外分光光度計檢測糖基化中間產物、游離氨基含量、褐變程度、二硫鍵、巰基的變化，并檢測了兩種加熱方式對糖基化后酪蛋白的分子量變化，分析結果，系統(tǒng)闡述微波加熱對酪蛋白糖基化反應的影響。
2.2.3 微波加熱對酪蛋白糖基化產物功能性質的影響

酪蛋白溶解在 0.667 mol/L 磷酸緩沖液里(pH7.8)，濃度為 6%，蛋白與 β 環(huán)糊精的比例（1：1w/w），反應溶液的量為 300mL，控制溫度 90℃，微波功率 100W、300W、500W 和 700W，加熱 10 min、20min、30 min，與水浴加熱（90℃,60min）和未處理酪蛋白雙對照，利用流變儀、質構儀、紫外分光光度計等檢測糖基化產物的凝膠性、乳化性、起泡性、抗氧化性的變化，系統(tǒng)闡述微波加熱對酪蛋白糖基化產物的影響。

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3 結果與分析.....................................................................31
3.1 微波加熱對酪蛋白糖基化反應進程的影響 .........................................31
3.1.1 酪蛋白成分分析 .............................................................31
3.1.2 微波的功率對糖基化反應的影響 ...............................................31
3.1.3 微波加熱時間對糖基化反應的影響..............................................32
4 討論............................................................................67
4.1 微波加熱蛋白質糖基化的優(yōu)勢 ..................................................67
4.2 微波加熱與水浴加熱對酪蛋白糖基化的影響 .......................................69
4.3 微波加熱對酪蛋白功能性質的變化 ..............................................70
4.4 微波加熱對酪蛋白結構變化....................................................73

5 結論...........................................................................76

4 討論

4.1 微波加熱蛋白質糖基化的優(yōu)勢
（1）蛋白質糖基化改性的必要性
蛋白質和糖類是組成食品體系的重要成分，在食品體系中處于共存狀態(tài)，二者之間的相互作用是影響食品體系流變學特性、穩(wěn)定性和口感的主要因素[184]。蛋白質和糖易發(fā)生接枝反應，且研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質與還原糖發(fā)生糖基化反應可以提高蛋白質的功能特性[185]。酪蛋白是一種重要的蛋白產品，已經(jīng)廣泛應用于食品及其他行業(yè)中，其蛋白質含量高達 90%以上[186]。但是沒有完美的食物，酪蛋白也不完美，它的乳化性、凝膠性等性質，不如某些植物源蛋白質的功能性質，而且它較差的溶解性也使它減分不少，限制其在食品工業(yè)中的廣泛應用，因此需要對酪蛋白進行改性處理來獲得優(yōu)良功能特性[187]。
酪蛋白是一種全價蛋白質，因為其氨基酸比例比較合理。酪蛋白可以作為很多食品的重要成分，是人們的關注的焦點。不可否認的是，酪蛋白也有自己的缺陷。例如：酪蛋白在等電點（pH 4.6）左右的時候，甚至 ph 值更小的時候，它的溶解度、乳化性都很不理想。在食品加工的過程中，酪蛋白就不能被應用于酸性體系的食品中。這也是我們對酪蛋白改性的目的和意義所在，也是酪蛋白改性的必要性所在。酪蛋白改性除了自身的缺點更得改善，另外一個好處就是蛋白質-糖改性后，可以作為優(yōu)良的多功能添加劑在食品中應用。反應產物中含有蛋白質、糖兩種天然生物分子，反應的條件中不需要任何化學催化劑參與，這個反應正符合了現(xiàn)代社會與日俱增的對天然添加劑的需求，因而反應產物會得到人們的肯定。 本論文研究了酪蛋白與還原糖的美拉德反應，檢測了接枝反應的程度，一定程度的提高了酪蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性、抗氧化性等功能性質，功能性質的改善會使酪蛋白在食品或醫(yī)藥等領域中的應用的更為廣泛，反應產物可以作為新型功能性食品配料、添加劑，這樣的研究是一種新的嘗試。
（2）傳統(tǒng)加熱糖基化的優(yōu)點與不足

社會的發(fā)展，提高了人們的生活水平，人們對食品的要求越來越高，蛋白質在食品的發(fā)展中的作用越來越重要。食品方向的研究人員經(jīng)過很長時間的努力，主要致力于改善蛋白質的功能特性，利用的改性方法是：物理方法、酰化、磷酸化、糖基化及去酰胺等化學方法，以及生物酶工程的方法�？偨Y以上所有的方法，各有優(yōu)缺點，例如化學方法因為會涉及一些有毒試劑，從而導致改性后的蛋白很難在食品行業(yè)應用，物理方法改性的效果不明顯。經(jīng)過以上分析，從 90 年代的初期開始，蛋白質改性的科研重點轉移到了蛋白質與糖的糖基化反應。蛋白質與糖只要加熱就可以自發(fā)地發(fā)生糖基化反應，反應的過程中沒有任何作為催化劑化學試劑添加。因此，我們可以通過反應條件的把控，來獲得我們所需要的糖基化產物，這將會成為蛋白改性的一個好的方法。

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5 結論

本研究工作得到以下 4 點主要結論：
1. 本論文研究表明，褐變程度和接枝度隨著微波功率和微波時間的增大逐漸增加，但是微波功率增加到 500W 以后接枝度的增加速率減少，微波時間 20min 以后接枝度的增加速率減少，綜合褐變程度來考慮，后續(xù)試驗選擇的功率為 500W，微波時間 20min。微波加熱時酪蛋白與還原糖的接枝反應的順序為 β 環(huán)糊精>葡萄糖>乳糖>低聚異麥芽糖。
2 ．內源熒光光譜和紫外光譜分析表明，微波加熱處理后酪蛋白在 220-238 nm 和260-340nm 的紫外吸收值高于水浴加熱的酪蛋白、未處理的酪蛋白，內源熒光吸收峰值發(fā)生紅移現(xiàn)象。微波加熱可以穩(wěn)定的促進酪蛋白與葡萄糖糖基化的進行，這樣的現(xiàn)象對于 β 環(huán)糊精來說并沒有發(fā)生，水浴加熱和微波加熱對于中間產物的影響不顯著。微波加熱對于酪蛋白與葡萄糖、β 環(huán)糊精的褐變程度（A420）顯著高于水浴加熱的樣品。微波加熱和水浴加熱對酪蛋白二硫鍵的含量變化不顯著，但是對于酪蛋白與葡萄糖、β 環(huán)糊精的糖基化反應后，二硫鍵的含量變化差異顯著。微波加熱 30 分鐘后的糖基化酪蛋白與水浴加熱 60 分鐘電泳條帶相似，間接說明微波加熱糖基化反應可以縮短時間，節(jié)約成本。

3．微波加熱對酪蛋白功能特性的影響：微波加熱處理對反應產物功能性質的改善程度不盡相同。試驗結果表明：當微波時間為 20min，微波功率為 500W 時，微波加熱糖基化產物凝膠強度為 134g，是水浴加熱的 1.19 倍。酪蛋白、水浴加熱糖基化酪蛋白和微波加熱（500W，20min）糖基化酪蛋白的持水性依次增加，分別為 5.08,13.13 和 17.1g.g-1蛋白質。酪蛋白、水浴加熱糖基化酪蛋白和微波加熱糖基化酪蛋白的吸油性下降。凝膠微觀結構分析：經(jīng)過糖基化處理后，酪蛋白-β 環(huán)糊精的接枝產物凝膠網(wǎng)狀空隙較小且孔徑大小均勻，微波加熱處理，凝膠網(wǎng)絡結構逐漸變得規(guī)則、致密。微波加熱處理的酪蛋白糖基化產物的表觀黏度最高，不僅高于水浴加熱處理的酪蛋白糖基化產物的，而且顯著高于未處理酪蛋白分散液的表觀粘度。在 0-6 個月的貯藏期間，酪蛋白與糖基化酪蛋白的凝膠硬度都下降，但變化不明顯。微波處理可以顯著提高接枝物的起泡性和起泡穩(wěn)定性。當微波加熱（500W，20min）和水浴加熱酪蛋白糖基化時，美拉德反應產物的還原能力分別為 0.59 和 0.57，顯著高于未經(jīng)過糖基化處理的酪蛋白還原能力(P < 0.05)。當微波處理 20min 時，隨著微波功率的增大，美拉德產物對脂質體過氧化的抑制率逐漸增加，當微波功率增加到 500W 時，由酪蛋白制得的美拉德反應產物對脂質體過氧化的抑制率可達 73.1%，顯著高于未經(jīng)加熱處理的樣品（63.42%）(P < 0.05)，水浴加熱后的酪蛋白美拉德產物對脂質體過氧化的抑制率為 67.13%，比未處理的樣品增加，但是沒有達到差異顯著的水平(P ＞ 0.05)。在微波功率增加到 500W 時，酪蛋白與 β 環(huán)糊精的產物對羥基自由基清除率從 6.97%提高到 14.937%，顯著高于未處理酪蛋白的自由基清除率（5.53%）(P < 0.05)，水浴加熱后美拉德反應產物的對羥基自由基清除率為 9.6%，比未處理酪蛋白的自由基清除率提高了 4.07%。微波處理對酪蛋白-β 環(huán)糊精產物的 EAI 和 ESI 都有顯著改善，這不僅與酪蛋白改性有關，可能還與微波輻射對酪蛋白結構的影響有關。

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參考文獻（略）

本文編號：45219