第一章 文獻(xiàn)綜述

中國(guó)是世界上最大的煙草生產(chǎn)國(guó)與消費(fèi)國(guó)，2009年英美煙草全球業(yè)績(jī)報(bào)告顯示，中國(guó)煙草占全球市場(chǎng)份額的41.4%，在烤煙種植面積、烤煙產(chǎn)量、卷煙產(chǎn)量、銷量額、卷煙產(chǎn)量銷量增長(zhǎng)量、吸煙人口、吸煙人口增長(zhǎng)率以及煙草利稅等方面均居全球第一(孔宏偉 2010)。2003年5月21日，中國(guó)代表團(tuán)參加第56屆世界衛(wèi)生大會(huì)，并正式簽署了《煙草控制框架公約》，成為了該公約的第77個(gè)締約國(guó)(陳振華 2013)，根據(jù)公約精神，我國(guó)煙草產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售、稅收等多個(gè)方面均受到更加嚴(yán)格的限制。

煙葉在種植、烘烤、倉(cāng)儲(chǔ)、加工等過(guò)程中極易受到病蟲(chóng)害的侵染。2002年，中國(guó)煙葉生產(chǎn)購(gòu)銷公司調(diào)查發(fā)現(xiàn)，花葉病、蝕紋病、馬鈴薯Y病毒病、黑脛病、赤星病等68種煙草侵害性病害以及煙蚜、煙青蟲(chóng)等害蟲(chóng)對(duì)煙葉危害較為嚴(yán)重。2007年，煙草全國(guó)病蟲(chóng)害發(fā)生面積達(dá)到83.15萬(wàn)公頃，直接產(chǎn)量損失高達(dá)9.4萬(wàn)噸(趙百東 2012)。因此，農(nóng)藥的使用必不可少。煙葉中農(nóng)藥的殘留是消費(fèi)者普遍關(guān)心的問(wèn)題，國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會(huì)(ACAC)在2003年提出了煙草農(nóng)藥殘留最高指導(dǎo)性限量，其中對(duì)99種農(nóng)藥的殘留限量做了規(guī)定，2008年的第二版擴(kuò)展至118種(CORESTA2008)，2013年的第三版中擴(kuò)展至120種(CORESTA 2013)。除此之外，目前國(guó)際上已有29個(gè)國(guó)家及地區(qū)(包括14個(gè)歐洲國(guó)家、9個(gè)亞洲國(guó)家或地區(qū)、4個(gè)非洲國(guó)家以及1個(gè)北美國(guó)家)對(duì)煙草農(nóng)殘?zhí)岢隽讼蘖恳�。因此，建立高靈敏度、高選擇性、更快速、更可靠的煙草農(nóng)殘檢測(cè)方法十分必要。

1.1 研究背景
1.1.1 煙葉農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀
1.1.1.1 農(nóng)藥及其使用簡(jiǎn)介

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所使用藥劑的總稱，又稱為農(nóng)用化學(xué)品(Agricultural chemicals,Agrochemical)或作物保護(hù)劑(Crop protection agents，CPA)。中國(guó)地理環(huán)境和氣候條件復(fù)雜，農(nóng)作物品種以及病蟲(chóng)草鼠害種類很多，每年發(fā)生的受害面積達(dá)到 30 多億畝。因此，農(nóng)藥作為一種重要的病蟲(chóng)害防治手段，能夠更加快速、有效、經(jīng)濟(jì)地防治有害生物，可以確保農(nóng)業(yè)豐收，在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用農(nóng)藥，可挽回?cái)?shù)倍乃至數(shù)十倍的經(jīng)濟(jì)效益損失。中國(guó)是農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用大國(guó)，我國(guó)每年農(nóng)藥的生產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了 265 萬(wàn)噸(王茂華等2012)，其中殺蟲(chóng)劑 71.1 萬(wàn)噸，占總產(chǎn)量的 26.9%；殺菌劑 15.2 萬(wàn)噸，占總產(chǎn)量的 5.7%；除草劑 117.3 萬(wàn)噸，占總產(chǎn)量的 44.3%。2013 年 1-12 月中國(guó)累計(jì)生產(chǎn)化學(xué)農(nóng)藥 318.95萬(wàn)噸，比 2012 年同增長(zhǎng)了 1.64%。

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1.2 農(nóng)殘分析方法的發(fā)展概況
農(nóng)藥殘留分析是指利用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)食品及環(huán)境當(dāng)中存在的含量水平為微量、痕量以及超痕量的殘留于其中的農(nóng)藥成分進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。農(nóng)殘分析的困難程度較高。首先，食品、煙草、環(huán)境當(dāng)中殘留農(nóng)藥的濃度水平極低，一般在 ng、pg 甚至 fg(10-9-10-15g)級(jí)別，需要對(duì)殘留農(nóng)藥的性質(zhì)以及各種分析方法有深刻的理解，否則容易造成誤判；其次，農(nóng)藥種類繁多，農(nóng)民在各種農(nóng)作物種植過(guò)程中選擇農(nóng)藥的范圍較大，且各地區(qū)使用的農(nóng)藥都有較大差異性，因此，分析的目標(biāo)物質(zhì)的不確定性較為突出，極大地增加了分析的難度；另外，不斷有新的農(nóng)藥投入市場(chǎng)，分析的方法也需要不斷更新。

根據(jù)分析目標(biāo)物的種類及數(shù)量，農(nóng)殘分析方法分為兩種類型，，分別是單殘留方法、多殘留方法。單殘留方法指的是針對(duì)某一種農(nóng)藥進(jìn)行定性及定量分析，一般用于農(nóng)藥注冊(cè)登記時(shí)進(jìn)行的相關(guān)分析，如最大殘留限量制定、具有特定目的農(nóng)藥分析或性質(zhì)研究。例如，利用氣相色譜法(GC)檢測(cè)新鮮煙葉或烤煙中的菌核凈成分的方法便是屬于單殘留方法(Liu et al. 2007)；多殘留分析方法指的是一次分析兩種或兩種以上農(nóng)藥種類的分析方法，這種分析方法也可以進(jìn)一步細(xì)分，例如，只分析同一類農(nóng)殘的分析方法，這種方法又被稱為選擇性多殘留方法(Selective multi-residue methods)，如 Vagi et al.(2007)等建立的利用超聲波輔助提取結(jié)合 GC-ECD 檢測(cè)海洋沉積物中的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留方法；另一種多殘留方法為一次分析多類及多種農(nóng)藥殘留，也被稱為多類多殘留方法(Multi-classmulti-residue methods)，如 Golge et al.(2015)所建立的利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析橙子中 115 種農(nóng)藥殘留的方法。除此之外，目前發(fā)展的分析方法還包括同時(shí)用于分析農(nóng)殘、環(huán)境污染物、添加劑等多種有害成分的方法(Han et al. 2014)。由于農(nóng)殘含量水平極低，不同的分析方法可能會(huì)造成分析結(jié)果有所差異。為減少誤差，需要對(duì)分析過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。圖 1-1 表示一般農(nóng)殘分析的步驟及具體操作。目前，農(nóng)殘分析方法種類很多，但基本步驟包括樣品采集及儲(chǔ)存、樣品前處理、樣品分析及數(shù)據(jù)分析四個(gè)部分。其中樣品前處理過(guò)程及樣品的分析過(guò)程是農(nóng)殘分析方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

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第二章 煙葉中農(nóng)藥多殘留的 GC/MS/MS 分析方法建立

2.1 前言
煙葉中農(nóng)藥殘留問(wèn)題已經(jīng)受到了消費(fèi)者以及煙草加工行業(yè)的廣泛關(guān)注，農(nóng)藥多殘留分析方法的建立是實(shí)現(xiàn)煙葉安全品質(zhì)高效監(jiān)管的必要條件。由于煙葉中農(nóng)藥殘留水平較低，一般在 ng 級(jí)別，因此，建立超靈敏度(LOQ<50 ng/g)和高選擇性的檢測(cè)方法很有必要。近些年來(lái)，樣品的前處理技術(shù)如超聲波輔助提取技術(shù)、固相萃取技術(shù)、加速溶劑萃取技術(shù)、QuEChERS 技術(shù)等已有很大進(jìn)步，使得煙葉農(nóng)殘的分析更加快速、高效。分析儀器的發(fā)展更為分析領(lǐng)域帶來(lái)了便利，例如，氣相色譜(GC)或液相色譜(LC)與質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)的聯(lián)用，甚至與三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的聯(lián)用，使分析儀器的靈敏度與選擇性大大提高。

QuEChERS 是一種目前較為流行的農(nóng)殘檢測(cè)樣品前處理方式，由英文單詞 quick、easy、cheap、effective、rugged 以及 safe 六個(gè)單詞的首字母縮寫(xiě)，該方法由 Lehotay 小組于 2003 年建立，是農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域中發(fā)展最快的方法之一，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低廉、高效、適應(yīng)性強(qiáng)以及操作安全等優(yōu)點(diǎn)。利用這種方法所得到的待檢樣品可以同時(shí)用于液相色譜或氣相色譜分析。十幾年的發(fā)展過(guò)程中，該方法已經(jīng)有了許多不同的版本。研究人員通過(guò)對(duì)其中目標(biāo)物提取方法、基質(zhì)成分凈化等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)整，并將其廣泛用在了水果、蔬菜、茶葉、煙葉中農(nóng)殘的分析當(dāng)中(王連珠 2012；郭春景 2013；陳建彪 2013；張媛媛 2014)。除此之外，利用這種方法所分析的目標(biāo)物也已經(jīng)突破了農(nóng)藥殘留的領(lǐng)域，如對(duì)重金屬、真菌毒素、環(huán)境污染物等成分的分析。對(duì)于 QuEChERS 方法來(lái)說(shuō)，無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、醋酸鹽等鹽類成分在待檢液脫水環(huán)節(jié)中的使用十分普遍，然而，這些鹽類成分在待檢液中的殘留容易沉積在質(zhì)譜檢測(cè)器離子源表面，從而降低質(zhì)譜檢測(cè)器的信號(hào)提取性能。Gonzalez-Curbelo et al. (2014)研究利用氯化銨、醋酸銨、甲酸銨等鹽類作為鹽析主要成分，較好地解決了這個(gè)問(wèn)題。該方法在煙葉農(nóng)藥殘留分析中是否同樣適用值得進(jìn)行深入研究與探討。另外，分析物保護(hù)劑(Analyte protectants, APs)已經(jīng)被用在水果(蘋(píng)果、檸檬)、蔬菜(西蘭花)及谷物(小麥)農(nóng)殘成分分析當(dāng)中(許秀麗2012；黃寶勇 2006；柴劍榮 2013)，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)有較好的消除作用，但在煙草農(nóng)殘分析過(guò)程中還未使用。

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2.2 試驗(yàn)部分
2.2.1 材料與方法
2.2.1.1 材料與試劑
所有待分析農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(共分為 10 組，每組待分析物濃度為 100μg/mL)及三苯基磷酸酯(TPP，內(nèi)標(biāo)，濃度為 20 μg/mL)購(gòu)買于美國(guó)安捷倫公司，于-20 ℃冰箱中保存；敵菌丹、二溴磷以及殺線威標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于德國(guó) labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；乙腈、甲苯(HPLC 級(jí))等有機(jī)溶劑購(gòu)買于韓國(guó) Duksan 公司；3-氧乙基 1, 2 丙二醇、谷洛糖酸內(nèi)酯、D-山梨醇以及莽草酸(純度均大于 95%)購(gòu)買于美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；檸檬酸鈉、醋酸鈉(純度均大于 95%)購(gòu)買于天津津東天正公司；甲酸銨、乙酸銨(純度均大于 95%)購(gòu)買于美國(guó) ACROS 公司；硫酸鎂購(gòu)買于天津科密歐公司；50mL 離心管及鹽析包(內(nèi)含 1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫鈉、4 g 無(wú)水硫酸鎂和 1 g 氯化鈉)試劑盒，以及2mL 離心管(內(nèi)含 150 mg 無(wú)水硫酸鎂、25 mg PSA)購(gòu)買于美國(guó)安捷倫公司；空白煙葉樣品來(lái)自于國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心。
2.2.1.2 儀器與設(shè)備
GC/MS/MS(美國(guó)，安捷倫)裝置由一套氣相色譜儀(型號(hào)：7890B)以及一套三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜裝置(型號(hào)：7000C)構(gòu)成，并配置一套自動(dòng)進(jìn)樣器(型號(hào)：7693)。氣相色譜儀(GC-2010 plus)，安裝 PTV 進(jìn)樣器；色譜柱采用 DB-5MS 柱(美國(guó)，安捷倫。長(zhǎng) 30 m、內(nèi)徑 0.25 mm、膜厚 0.25 μm)；3-30K 冷凍離心機(jī)(德國(guó)，Sigma)；EOFO-945066 型多管式渦旋儀(美國(guó)，Talboys)；BSA224S-CW 電子天平 (德國(guó)，Sartorius)；Milli-Q 超純水系統(tǒng) (美國(guó)，Millipore)。
2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置
混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：從-20 ℃冰箱中取出 10 組混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，待溫度上升至常溫后，從每只混合標(biāo)液小瓶中吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL至棕色容量瓶中，用乙腈：甲苯(2:1，v:v)混合溶液定容至 10 mL，混勻后轉(zhuǎn)移至 12 mL 棕色瓶中待用。
分析物保護(hù)劑的配制：天平稱取 3-氧乙基 1, 2 丙二醇 100 mg、谷洛糖酸內(nèi)酯 10 mg、D-山梨醇 10 mg 以及莽草酸 5 mg 至 10 mL 容量瓶中，用乙腈：水(4:1，v/v)混合溶劑溶解(水的作用是促進(jìn)極性分析物保護(hù)劑溶解)。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確移取 5 μL、10 μL、25 μL 、50 μL、100 μL、250 μL、500μL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于 10 mL 容量瓶中，每個(gè)容量瓶中加入內(nèi)標(biāo)工作液 100 μL，用乙腈：甲苯(2:1，v/v)溶液定容，即得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，具體濃度為：1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，50 μg/L，100 μg/L，200 μg/L。

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第三章 基于在線 GPC-GC/MS/MS 的煙葉農(nóng)藥殘留分析方法建立 ................55
3.1 前言............................................................ 55
3.2 試驗(yàn)部分.......................................................... 56
第四章 UPC2同時(shí)檢測(cè)溴氫菊酯和四溴菊酯研究.............................79
4.1 前言............................................................ 79
4.2 試驗(yàn)部分........................................................ 80
第五章 UPC2在煙葉除草劑檢測(cè)中的應(yīng)用..................................86
5.1 前言......................................................... 86

5.2 試驗(yàn)部分..................................................... 87

第五章 UPC2在煙葉除草劑檢測(cè)中的應(yīng)用

5.1 前言
除草劑是一類用于抑制雜草生長(zhǎng)的農(nóng)用化學(xué)品，應(yīng)用除草劑可以有效增加作物產(chǎn)量，并節(jié)約勞動(dòng)力(Li et al. 2011; Liao et al. 2013; Zhao et al. 2009)。由于具有高殘留毒性及其超量使用問(wèn)題，除草劑已經(jīng)開(kāi)始被廣泛關(guān)注(Liao et al. 2013)。由于煙葉具有較大的比表面積，與其他作物相比，煙葉具有更加嚴(yán)重的殘留風(fēng)險(xiǎn)(Ferris et al. 2011)。除草劑屬于內(nèi)吸性農(nóng)藥，一旦與人體接觸，其很容易被皮膚及衣物等吸收，從而導(dǎo)致持久及重復(fù)地暴露問(wèn)題(Li et al. 2011)。而且，在煙葉的后期加工過(guò)程中，除草劑并不能夠被完全去除。這樣，此類化合物就會(huì)很容易進(jìn)入吸煙者及其周圍人體內(nèi)，進(jìn)而增加健康危害(CORESTA2013)。國(guó)際煙草科學(xué)合作組織已經(jīng)分別對(duì)敵草胺，甲草胺，精喹禾靈，雙苯酰草胺，異丙甲草胺及異噁草酮等 6 種除草劑的最大殘留量進(jìn)行了限定，具體為 0.1 mg/kg，0.1mg/kg，0.2 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.2 mg/kg (Yang et al. 2013)。因此，煙葉中除草劑的衡量測(cè)定及監(jiān)控方法的發(fā)展與建立是非常重要的。
為減少除草劑對(duì)人體的危害性，目前，許多可靠的檢測(cè)方法如氣相色譜(Liao et al.2013; Zhao et al. 2009)及液相色譜(Zhang et al. 2011)等被建立并用于實(shí)際樣品的分析。而且，多種檢測(cè)器如電子捕獲檢測(cè)器(ECD)、火焰光度檢測(cè)器 (FPD) (Zhao et al. 2008)、二極管陣列檢測(cè)器(PDA) (Rahman et al. 2012)以及單級(jí)及串聯(lián)質(zhì)譜(MS、MS/MS)(Ferris etal. 2011; Lan et al. 2014)被安裝至色譜儀以獲得較好的儀器分析效果。盡管這些檢測(cè)器具有較好的選擇性或靈敏度，要想獲得可靠的分析結(jié)果，良好的分離效果依然是十分重要的(Chen et al. 2013)。每種分離方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)。例如，氣相色譜儀具有較好的選擇性和靈敏度(Novakova et al. 2014)，但是由于運(yùn)行溫度往往處在較高的水平(一般為 90 ℃-300 ℃)，而且運(yùn)行的時(shí)間較長(zhǎng)。有研究采用氣相色譜分析 5 種除草劑，儀器分析時(shí)間為 27 min (Mayer et al. 2009)。液相色譜也具有一些缺點(diǎn)，例如，液相色譜一般需要較大體積的有機(jī)溶劑或化學(xué)試劑作為流動(dòng)相。因此，采用更加簡(jiǎn)便、省時(shí)及綠色環(huán)保的分析方法依然是煙草除草劑超靈敏檢測(cè)的研究應(yīng)用方向。

圖 5-1 展示了 6 種目標(biāo)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式，其中大多數(shù)具有相似的酰胺類結(jié)構(gòu)和相近的官能團(tuán)。本章將重點(diǎn)研究及優(yōu)化 UPC2參數(shù)對(duì) 6 種目標(biāo)物質(zhì)的影響，并對(duì)前處理過(guò)程進(jìn)行研究。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草中 6 種除草劑的 UPC2同時(shí)分析。

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第六章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望

煙草中農(nóng)藥殘留問(wèn)題已經(jīng)越來(lái)越受到消費(fèi)者和相關(guān)的管理部門(mén)及生產(chǎn)企業(yè)的重視。本文的目的是研究更加快速、高效、高通量，具有較高靈敏度及選擇性，分析過(guò)程更加穩(wěn)定，分析結(jié)果可靠的檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用在煙草農(nóng)殘的實(shí)際檢測(cè)當(dāng)中。內(nèi)容主要包括以下三個(gè)方面：首先，研發(fā)了以銨鹽作為鹽析試劑的煙葉樣品預(yù)處理技術(shù)，采用分析物保護(hù)劑進(jìn)行 GC-MS/MS 分析，建立了煙草中農(nóng)藥多殘留的分析方法，提高了常規(guī) GC-MS/MS 法對(duì)煙葉中農(nóng)藥多殘留分析結(jié)果的檢測(cè)可靠性；其次，建立了煙葉中農(nóng)藥多殘留分析的在線 GPC-GC-MS/MS 分析方法，探索了樣品提取試劑、凈化模式等樣品前處理模式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，對(duì) GPC 的基本參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終獲得了較好的分析效果；最后，研究了煙草中除草劑及擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的 UPC2多農(nóng)殘檢測(cè)方法，對(duì) 6 種除草劑及 2 種擬除蟲(chóng)菊酯的 UPC2參數(shù)、提取劑凈化過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了各種目標(biāo)物質(zhì)的高效分離檢測(cè)。以下為本研究的主要結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)。同時(shí)，對(duì)相關(guān)研究的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

6.1 結(jié)論
6.1.1 煙葉銨鹽鹽析預(yù)處理技術(shù)及分析物保護(hù)劑在GC-MS/MS農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用

研發(fā)以銨鹽作為鹽析試劑的煙葉樣品預(yù)處理技術(shù)，并采用分析物保護(hù)劑進(jìn)行GC-MS/MS 分析，獲得以下結(jié)果：(1)通過(guò)改變前處理過(guò)程中的鹽析試劑，利用熔點(diǎn)和沸點(diǎn)均低于質(zhì)譜運(yùn)行溫度的甲酸銨作為鹽析試劑，有效減少殘留鹽份在離子源表面形成沉淀的問(wèn)題，延長(zhǎng)了離子源維護(hù)后的正常運(yùn)行時(shí)間；(2)通過(guò)采用分析物保護(hù)劑(3-氧乙基 1, 2 丙二醇、古洛糖酸內(nèi)酯、D-山梨醇以及莽草酸等)與煙葉基質(zhì)共同配標(biāo)，有效保證了分析目標(biāo)物在儀器分析過(guò)程中的響應(yīng)值，分析結(jié)果更加可靠。經(jīng)過(guò)研究，本方法能夠?qū)熑~中 150 種農(nóng)藥殘留成分進(jìn)行檢驗(yàn)，所分析的大部分農(nóng)殘目標(biāo)物回收率在70%-120%范圍，日內(nèi)精密度及日間精密度理想。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：128485