1 文獻綜述

國內(nèi)也有不少研究毒死蜱與化合物對生物的復合污染，主要是研究復合污染對生物的毒性評估、毒性效應(yīng)以及對生物標志物的影響等。如同為有機磷農(nóng)藥的毒死蜱與樂果聯(lián)合染毒增加大鼠肝臟 SOD、CAT 兩種抗氧化酶的活性以及過氧化物 MDA 的濃度，聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加[5]。趙于丁等發(fā)現(xiàn)毒死蜱與氟蟲腈等 4種農(nóng)藥混合能對斑馬魚的乙酰膽堿酶、P450 酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶有不同的指示作用，如誘導 GST 活性等，達到良好的檢測效果[6]。付瑤等發(fā)現(xiàn)毒死蜱與阿特拉津聯(lián)合暴露對鯉魚的亞慢性效應(yīng)時的肝組織出現(xiàn)病理變化，肝、鰓的自由基活性與過氧化酶的活性變化影響機體正常的生理機能，具有毒性作用[7]。文一等研究了毒死蜱與氧化樂果混合污染使 SD 大鼠的精子出現(xiàn)多種畸形現(xiàn)象，導致精子質(zhì)量降低，對細胞造成損傷，對大鼠的生殖毒性與神經(jīng)毒性具有協(xié)同作用[8]。國內(nèi)研究對乙草胺的復合污染對脊椎動物的報道較少，但對微生物與蚯蚓有少量的報道。梁繼東等人發(fā)現(xiàn)不同濃度的 Cu 與乙草胺混合對赤子愛蚯蚓的毒性變化不一，高濃度的增加毒性作用，提高了土壤生態(tài)系統(tǒng)的毒性[9]。張惠文等學者同樣發(fā)現(xiàn) Cu 與乙草胺的復合污染具有相加作用，對土壤的呼吸強度與酶活性產(chǎn)生影響[10]。馬愛軍等人發(fā)現(xiàn)毒死蜱與乙草胺復合污染抑制土壤中微生物過氧化氫酶活性，對土壤微生物中的生物碳量隨著時間不同發(fā)生變化[11]。

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2 農(nóng)藥毒死蜱、乙草胺對熱帶爪蟾胚胎的致畸效應(yīng)

2.1 前言

隨著農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展和大面積的推廣使用，其污染效應(yīng)也擴展到整個生態(tài)系統(tǒng)。研究表明，所施除草劑20%以上會長期殘留在土壤中，殺蟲劑的10%-20%會附著在作物表面，大部分殘留通過降雨、沉降、徑流進入河流湖泊。毒死蜱（Chlopyrifos）是我國最主要的殺蟲劑的品種，使用量大。有研究顯示毒死蜱可以影響 Rhinella arenarum 胚胎發(fā)育和其體內(nèi)的多胺的代謝[37]；同時有研究得知，大量的毒死蜱殘留影響墨西哥鈍口螈早期的胚軸分化，導致胚胎畸形[97]。乙草胺（Acetochlor）屬于酰胺類除草劑，其原藥在我國使用量已超過 107kg。有報道顯示，乙草胺從地表水、地下水，甚至在飲用水中也被頻繁地檢測出來，對人體健康存在潛在的基因毒性，對水生生物和食草鳥類有較高的風險[98]。近幾年，全球兩棲動物種群衰退的現(xiàn)象十分嚴重，一些化合物被認為是重要的污染源[99]。據(jù)此，本章選用毒死蜱、乙草胺對熱帶爪蟾胚胎進行單一及聯(lián)合暴露，研究其對熱帶爪蟾的致畸效應(yīng)，為探索污染物對兩棲類種群的影響提供科學依據(jù)，也為后續(xù)的致畸機制的研究提供一定的理論依據(jù)。

2.2 材料與方法

熱帶爪蟾成蛙（Xenopus tropicalis）購于浙江大學生命科學院。成蛙雌雄分開飼養(yǎng)，實驗室內(nèi)構(gòu)建水循環(huán)系統(tǒng)，水循環(huán)系統(tǒng)的自來水經(jīng)過活性炭柱和微孔過濾系統(tǒng)，溶解氧≥5mg/L,余氯<3μg/L，pH 控制在 7.0-8.0。飼養(yǎng)過程中水溫控制在26±2℃，光暗比為 12h：12h。喂食采用冰凍的紅蟲或牛肝，隔天喂食，喂食完之后進行 2 小時紫外燈消毒。挑選多對性成熟的熱帶爪蟾，進行人工注射 HCG 的方法誘導產(chǎn)卵。待熱帶爪蟾抱對產(chǎn)卵結(jié)束后，收集胚胎。在顯微鏡下挑選發(fā)育健康的胚胎、發(fā)育階段一致（NF10-11 階段）的胚胎，用 2%的 L-半胱氨酸溶液進行脫膜，脫膜的時間大概需持續(xù) 2h-3h。

2 農(nóng)藥毒死蜱、乙草胺對熱帶爪蟾胚胎的致畸效應(yīng)…………11

2.1 前言…………11
2.2 材料與方法………11 
2.3 數(shù)據(jù)處理……………14
2.4 實驗結(jié)果………………14
3 毒死蜱、乙草胺復合污染對熱帶爪蟾胚胎致畸機制的初探………………43
3.1 前言…………43
3.2 材料與方法…………43 
3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析………47
3.4 試驗結(jié)果……………47 
4 全文總結(jié)………….57
4.1 結(jié)論………………………………57
4.2 不足與展望……………58

3 毒死蜱、乙草胺復合污染對熱帶爪蟾胚胎致畸機制的初探

3.1 前言

HOX 基因（Homeobox genes），是哺乳類動物的同源異型盒基因的其中一類基因，成簇的排列在不同染色體上，按照胚胎發(fā)育期的前-后軸方式表達[70]。該家族基因?qū)儆诎l(fā)育基因，對生物體的發(fā)育有時間和空間的調(diào)控，其對胚胎組織與器官的形成具有重要的調(diào)控作用，尤其是對動物體節(jié)與體型的發(fā)育[113,114]。從而可以得知，脊椎動物的肢體發(fā)育與 HOX 基因密不可分。有研究指明，脊椎動物胚胎的前后軸分化主要由 HOX 基因決定[115]。HOXA3 主要是控制脊椎動物的頭部發(fā)育，HOXA11 與 HOXA13 主要是調(diào)節(jié)骨骼的形成，主要表達是在胚胎發(fā)育的后期。本實驗中運用實時熒光定量 PCR（Real-Time PCR）的檢測方法，研究 FETAX急性毒性實驗中毒死蜱、乙草胺單一及復合污染下不同時段對熱帶爪蟾胚胎的HOXA3、HOXA11、HOXA13 基因表達差異的影響，探討農(nóng)藥毒死蜱、乙草胺對胚胎的致畸效應(yīng)及其機制。

3.2 材料與方法

挑選大小一致、顏色均一的胚胎進行實驗，將胚胎暴露在 12 孔板中，每個孔板放置 2 顆胚胎卵，實驗設(shè)三個重復。熱帶爪蟾胚胎分別染毒于 4 組試劑中：毒死蜱單劑濃度 0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/L，乙草胺單劑 0.5，1，2，4 mg/L中，毒死蜱致畸中濃度（0.4327 mg/L）與乙草胺一系列濃度 0.5，1，2，4 mg/L的混劑中，乙草胺致畸中濃度（2.70mg/L）與毒死蜱一系列濃度 0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/L 的混劑中。實驗過程中挑出死亡的胚胎，分別收取 48h 與 96h 的每個濃度的存活胚胎，用于提取胚胎的總 RNA，為后續(xù)的熒光定量 PCR 分子實驗做準備。若不及時做分子實驗，也可先將收集的胚胎用液氮保存在-70℃冰箱中。

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4 全文結(jié)論

4.1 結(jié)論

本文以熱帶爪蟾胚胎作為研究對象，比較研究了毒死蜱、乙草胺單一及農(nóng)藥毒死蜱-乙草胺復合污染96h 對胚胎的急性毒性以及致畸的影響，得到了致畸中濃度 TC50、死亡率、致畸率的變化。在從形態(tài)學上，觀察到了四種典型的畸形表型。當胚胎暴露 72h 后，取典型的致畸胚胎樣品固定做組織切片，從組織水平更進一步的闡述了觀察到的致畸表型以及發(fā)現(xiàn)胚胎新的組織病理變化。最后運用熒光定量 PCR 的方法，檢測兩種農(nóng)藥單劑及聯(lián)合暴露下胚胎 48h 與 96h 對基因HOXA3、HOXA11、HOXA13 表達量之間的差異，從分子水平解釋其對胚胎的致畸機制。本論文得出的實驗結(jié)果與結(jié)論，主要概括為以下幾點：1、熱帶爪蟾胚胎在毒死蜱、乙草胺 FETAX 急性毒性實驗中，得出其致畸中濃度 TC50分別為 0.4327、2.70mg/L，毒死蜱與 2.70 mg/L 乙草胺復合污染的TC50為0.3493 mg/L，乙草胺與 0.4327 mg/L 毒死蜱復合污染的 TC50為 1.06 mg/L。從所得 TC50數(shù)值表明，胚胎在毒死蜱與乙草胺單劑暴露下 96h 的 TC50大于其兩種不同比例復合污染的值，表明復合污染對胚胎的致畸毒性強于單劑暴露。胚胎分別暴露在毒死蜱、乙草胺單劑 96h，兩者的致畸率都隨著濃度的增加而升高，呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。從 FETAX 試驗結(jié)果可以得出，毒死蜱、乙草胺為兩種典型的致畸化合物。

4.2 不足與展望

1、在 FETAX 實驗過程中，，對熱帶爪蟾胚胎畸形表型觀察過程中還不夠全面，不夠系統(tǒng)，需進一步加強。在組織切片實驗中，本論文取了典型的致畸樣品進行觀察試驗，如可以，可從低濃度到高濃度對每類畸形表型進行切片觀察，然后進行畸形表型的等級劃分，能更加直觀、系統(tǒng)的分析藥物在不同濃度作用下對胚胎造成的組織病理變化，為后續(xù)的致畸機制實驗提供更準確的方向。2、本論文選取了與胚胎發(fā)育相關(guān)的三個 HOX 基因，HOXA3、HOXA11、HOXA13。在毒死蜱、乙草胺單一及復合污染處理組中，雖發(fā)現(xiàn)這三個基因表達差異與觀察到的畸形表型有關(guān)，但還需對 HOXA3、HOXA11、HOXA13 的具體的調(diào)控機制進行研究，這樣對胚胎的發(fā)育會具有更深的研究意義。

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參考文獻（略）

本文編號：128481