第一章引言

水或其他液體堵塞呼吸道，出現(xiàn)呼吸障礙而發(fā)生機械性死亡稱為溺死. 據(jù)統(tǒng)計，每年全世界有14萬人溺死[2]。我國沿海、沿江地區(qū)溺死的案件也很多，據(jù)統(tǒng)計，溺死尸體約占法醫(yī)尸體檢驗的20%。珠江三角洲地區(qū)河道水網(wǎng)密集，每年發(fā)現(xiàn)的水中尸體達1000多具。溺死是由于大量液體進入呼吸道所引起的窒息死亡。在江河湖海中發(fā)現(xiàn)的尸體絕大多數(shù)屬于意外溺水死亡，但也部分為自殺或他殺，還有部分是死后拋尸入水偽造意外溺水身亡，因此水中尸體可能與刑事案件相關，必須進行法醫(yī)學鑒定。確定生前入水和死后入水是解決此類案件的關鍵。據(jù)調查，每年全世界因溺死導致死亡的人數(shù)達到3.5/10萬，對于未成年人，溺死排在意外死亡原因的第二位，因此對水中尸體死因的正確鑒定直接關系到尸體檢驗的質量和案件的定性。對于新鮮的水中尸體，可通過體表改變、內部器官征象、組織病理學檢驗以及左右心腔內血液成份的不同等進行溺死鑒定。但是，法醫(yī)學實踐中遇到的水中尸體大部分已腐敗或髙度腐敗，甚至已經(jīng)白骨化，這類尸體的各種溺死征象已不存在，死因診斷是國際法醫(yī)學界公認的難題。此時往往需要通過一些輔助檢測方法來診斷溺死，其中相對成熟的方法是桂藻檢驗法（主要包括光鏡下、電鏡下形態(tài)學觀察和計數(shù))。硅藻細胞壁含無結晶的不易被破壞的含水桂酸鹽（Si02.H20),能對外界環(huán)境變化有較強的抵抗力，有實驗表明進入肺臟內的硅藻較少受到腐敗等因素的影響，因此桂藻檢測成為診斷溺死的重要輔助手段之一。
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第二章PCR-Agarose電泳檢測桂藻SSU基因方法建立

2.1材料
于冬季，在南沙虎門大橋處，將生前溺死組實驗兔置籠中，沉入海水下0.5m5s后提出水面10s,再重新沉入相同海水深處，重復上述步驟直致實驗兔溺死，死后在水下0.5m處浸泡24h;死后入水組采用空氣栓塞法處死后’置于相同海水深度浸泡24h后取出；對照組釆用空氣栓塞法處死后不做任何處理。提取各組兔子肺、肝、腎邊緣部位組織置于一40°C冰箱保存。提取一份溺死地點水樣l00Ml。

2.2方法
對60只實驗動物的組織臟器用重蒸水反復沖洗，去除組織外的包膜，分別在不同組織的邊緣部位取材，用潔凈的眼科剪將組織剪碎至勻裝，取適量上述組織分別置入不同的潔凈15ml eppendorf管中，在eppendorf管中加入O.Olmol/LTris-Hcl緩沖液10ml后，分別加胰蛋白酶于不同管中使其濃度為20mg/ml，置5(rC恒溫箱內6h后觀察，待液體近透明時，12 OOOrpm離心30min后，緩慢取出離心管，用潔凈的吸管吸去上層上清液（極力避免震蕩），底層含有硅藻，用于下游實驗。將冰箱內的桂藻水樣及用于陰性對照的非桂藻水樣取出，解凍后上次混勾數(shù)次，用潔凈的吸管吸取2ml水樣置于潔凈的離心管中，12 OOOrpm離心30min后，緩慢取出離心管，用潔凈的吸管吸去上層上清液（極力避免震蕩)，底層含有桂藻，用于下游實驗。制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50 ml,)：稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70 ml,(50inl)lxTAE,瓶口倒扣小燒杯或用錫紙將錐形瓶瓶口封住，微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，核酸染色劑。膠板制備：取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好，形成模子。將內槽置于水平位I并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勾小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展幵，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加IxTAE電泳緩沖液至沒過膠板l-2mm為止。

第三章PCR-CE法檢測硅藻SSU基因 ......18
3.1材料............ 19
第四章PCR-DHPLC法檢測硅藻SSU基因 ...........29
4.1材料........ 31
 4.2方法.........32
全文小結 ........40

第四章PCR-DHPLC法檢測桂藻SSU基因

4.1材料
20只溺死實驗動物的肝、腎、肺組織已在上述實驗中提取并保存于-4(rc冰箱；10例溺死診斷陽性的人體器官組織檢材由廣州市刑事科學技術研究所提供；對照樣本：廣州珠江段5種最常見桂藻樣本(小環(huán)藻，直鏈藻，，菱形藻，針桿藻,舟形藻）由中國科學院水生生物研究所提供;實驗動物溺死地點水樣100ml己在上述實驗中提取并保存。

4.2方法
對10例溺死診斷陽性的人體組織器官和溺死動物的組織器官用重蒸水反復沖洗，去除組織外的包膜，分別在不同組織的邊緣部位取材，用潔凈的眼科剪將組織剪碎至勾衆(zhòng)，取適量組織置于不同的潔凈15inl eppendorf管中，在eppendorf管中加入Tris-Hc緩沖液10ml后，分別加胰蛋白酶于不同管中使其濃度為20nig/ml，置恒溫箱內6h后觀察，待液體近透明時，12OOOrpm離心30mm后，緩慢取出離心管，用潔凈的吸管吸去上層上清液（極力避免震蕩)，底層含有桂藻，用于下游實驗。將冰箱內的硅藻水樣及溺死地點水樣取出，解凍后上次混勾數(shù)次，用潔凈的吸管吸取2ml水樣置于潔凈的離心管中，12 OOOrpm離心30min后，緩慢取出離心管，用潔凈的吸管吸去上層上清液（極力避免震蕩)，底層含有硅藻，用于下游實驗。通過使用Transgenomic公司DHPLC檢測儀自帶的Navigator軟件包和斯坦福大學提供的在線軟件 DHPLC Melt Program可對所有擴增片斷的檢測溫度和分離梯度進行預測，根據(jù)預測的結果選擇最佳的檢測溫度和分離梯度，在該檢測溫度下要求片斷的大部分區(qū)域處于50%?99%的雙鏈狀態(tài)。在對DHPLC的檢測溫度和梯度進行實際摸索。
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全文小結

本研究采用LAURA㈣]等報道的引物擴增硅藻SSU基因，主要解決了以下幾個問題：1、動物實驗顯示，生前溺死組桂藻檢出率明顯高于死后入水組和陸地死亡組(p<0.05).證明通過PCR檢測硅藻SSU基因可有效區(qū)分生前溺死和死后入水。2、PCR-DHPLC法檢驗桂藻種類較微波消解法陽性率高（p<0.05),能減小誤差和減少工作量，特別適用于桂藻含量少，傳統(tǒng)法不易檢出的樣本。3、PCR-DHPLC法不僅可以檢出硅藻，還可檢驗PCR產(chǎn)物構象，為判斷溺死人體臟器內桂藻種屬與溺死地點桂藻種屬是否相同提供依據(jù)，可為溺死地點推斷提供更多信息。4、PCR-CE法檢驗桂藻具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，且易推廣應用，為同時檢測多種浮游生物提供新思路。
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參考文獻（略）