第一章 文獻綜述

1.1 線粒體及其功能概述
1.1.1 線粒體基本結(jié)構(gòu)與功能
線粒體的結(jié)構(gòu)包括外膜（outer-membrane）、內(nèi)膜（inter-membrane）、膜間隙（innermembrane）和基質(zhì)（matrix），其中內(nèi)膜會向基質(zhì)折疊形成嵴（cristae）（Mathews et al.2000）。線粒體的外膜具有良好的通透性，多數(shù)小分子（小于 500 Da）可以完全滲透通過，大分子物質(zhì)依靠膜上的轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運。膜間隙中的內(nèi)容物組成與細胞質(zhì)相類似，包括眾多生化反應(yīng)的底物、酶和輔助因子。其中，腺苷酸激酶、單磷酸激酶和二磷酸激酶等能量物質(zhì)的氧化磷酸化所需要的激酶含量高。內(nèi)膜具有高度選擇性，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（還原型 NADH、氧化型 NAD+）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原型 NADPH，氧化型 NADP+)，同時也包括核苷酸都是不可滲透通過的。相應(yīng)的內(nèi)膜具有更多的轉(zhuǎn)運體如核苷酸轉(zhuǎn)運體等（Mathews et al. 2000）
線粒體消耗細胞內(nèi) 95-98%的氧氣，而這一過程是發(fā)生在呼吸鏈（電子傳遞鏈）細胞色素氧化酶即 complex IV 位點上，將其還原為 H2O （Cadenas 2004）。氧化磷酸化期間，電子在氧化還原反應(yīng)中從電子供體轉(zhuǎn)移到電子受體，并且提供能量將質(zhì)子從基質(zhì)泵入內(nèi)膜空間，在內(nèi)膜兩側(cè)形成了質(zhì)子濃度梯度，所產(chǎn)生的勢能便是電子傳遞鏈的驅(qū)動力。而當(dāng)質(zhì)子通過ATP合酶即complex V流回基質(zhì)時，所產(chǎn)生的驅(qū)動能量將ADP合成為ATP（Cadenas 2004）。然而在電子傳遞過程中，有 2-3%的電子無法到達細胞色素氧化酶位點并從呼吸鏈的 complex I 即輔酶 Q 處泄露（Cadenas 2004）。電子泄露是非酶還原 O2的基礎(chǔ)，并通過單電子的轉(zhuǎn)移形成了自由基，包括：超氧陰離子 O2.–，和過氧化氫 H2O2。由于這些自由基會氧化電子傳遞鏈上的組成蛋白（失活）、三羧酸循環(huán)上的酶以及膜上的脂質(zhì)最終導(dǎo)致線粒體的氧化應(yīng)激，所以一些線粒體靶向的治療手段是以通過抑制從輔酶 Q 處產(chǎn)生的電子泄露來減少氧化物和自由基的產(chǎn)生，保護線粒體不受氧化應(yīng)激的損傷（Sheu et al.2006）。

除了電子傳遞鏈的電子泄露，線粒體還可以通過單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）產(chǎn)生過氧化氫（Cohen 1987）。單胺氧化酶是一種位于線粒體外膜上的酶，包括MAO-A 和 MAO-B 兩種。單胺氧化酶是以包括 5-羥色胺（serotonin）、去甲腎上腺素（norepinephrine）、　-苯乙胺（　-phenyl-ethylamine）等膳食中的胺類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（mono-amine neurotransmitters）為底物的。由單胺氧化酶介導(dǎo)的反應(yīng)副產(chǎn)物包括一些神經(jīng)毒性物質(zhì)如 H2O2、醛類物質(zhì)（aldehydes）（Edmondson 2014）。

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1.2 線粒體功能異常與相關(guān)疾病
二十世紀五十年代，Harman 提出的“free radical theory of aging”指出正常代謝產(chǎn)生的自由基可能是衰老的根本原因（Harman 1955）。二十世紀八十年代 Miquel 等人又將該理論進一步拓展，提出由積累性損傷導(dǎo)致的 mtDNA 的突變是人體衰老和一些退行性疾病的主要原因，而該衰老理論也變?yōu)椤癕itochondrial theory of aging”（Miquel et al.1980）。除了衰老之外，線粒體參與了包括肥胖、代謝綜合征、心血管疾病等許多疾病的發(fā)展過程。下面結(jié)合本研究內(nèi)容，從神經(jīng)退行性疾病和癌癥兩方面闡述疾病與線粒體功能之間的聯(lián)系。
1.2.1 線粒體與神經(jīng)退行性疾病
人的大腦組織每時每刻消耗能量巨大，故而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常運作十分依賴于線粒體的功能。許多神經(jīng)退行性疾病都與線粒體失活包括：線粒體供能下降、線粒體產(chǎn)生自由基過高、線粒體動態(tài)平衡紊亂等相關(guān)（Lin and Beal 2006）。

阿茲海默癥（Alzheimer’s Disease,AD）又稱腦退化癥，是一種由于腦中神經(jīng)纖維糾結(jié)和老年斑塊導(dǎo)致的持續(xù)性神經(jīng)功能障礙。　淀粉樣蛋白（　-amyloid protein，A　）的沉積可能是導(dǎo)致 AD 的根本原因。一些研究表明線粒體的失活與氧化應(yīng)激均參與 AD的發(fā)展過程。在轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)基因動物中，過表達的淀粉樣蛋白前提蛋白（precursoramyloid protein，APP）會阻塞線粒體蛋白轉(zhuǎn)運機制，并引起線粒體失活、能量代謝功能受損。在 AD 病人和轉(zhuǎn)基因鼠中，　淀粉樣蛋白與線粒體基質(zhì)中的乙醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase）結(jié)合，引起線粒體氧化應(yīng)激并損傷線粒體呼吸鏈�！〉矸蹣拥鞍走�可以與線粒體內(nèi)一種促凋亡蛋白 HtrA2/Omi 結(jié)合并釋放到細胞質(zhì)中引起凋亡。AD 病人的海馬組織中，與線粒體動態(tài)融合相關(guān)的 Drp-1，OPA1，Mfn1/2 等蛋白表達下降，而與線粒體分裂相關(guān)的 Fis1 表達卻上升，表明　淀粉樣蛋白通過增加線粒體分裂調(diào)控線粒體的動態(tài)平衡。并且在過表達 APP 的海馬組織神經(jīng)元中，線粒體聚集在細胞核周圍，表明　淀粉樣蛋白還會抑制線粒體的運輸影響突觸可塑性（Swerdlow 2011）。綜上，　淀粉樣蛋白的聚集會導(dǎo)致線粒體失活，進而引起細胞功能的紊亂，這可能是 AD 重要的發(fā)病機制。

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第二章 丙烯酰胺誘導(dǎo) BV2 神經(jīng)小膠質(zhì)細胞凋亡與線粒體調(diào)控機制

2.1 引言
近年來有報道稱食品危害物丙烯酰胺誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平升高，一些動物實驗和臨床研究也證明丙烯酰胺具有一定的神經(jīng)毒性。丙烯酰胺可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞瘤細胞（U-1240 MG）、原代星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)母瘤細胞（SH-SY5Y）發(fā)生凋亡（Chen et al. 2013; Lee et al. 2014; Sumizawa and Igisu 2007）。近期研究表明丙烯酰胺的暴露還會損傷血腦屏障、損傷其分泌和轉(zhuǎn)運功能（Yao et al. 2014）。然而，尚未有針對丙烯酰胺對小膠質(zhì)細胞毒性及毒性機制的研究。

神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中功能最重要的三種細胞，如圖 2-1 （Allen and Barres 2009）。星形膠質(zhì)細胞最主要的功能是對神經(jīng)元的支持與營養(yǎng)供給。而小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的免疫細胞。小膠質(zhì)細胞會在多種外界刺激下激 活 ， 如 LPS ， 百 草 枯 ， 亞 乙 基 雙 - 二 硫 代 氨 基 甲 酸 錳 （ manganeseethylene-bisdithiocarbamate）等 （Carvey et al. 2003; X-F Wu et al. 2005; Y Zhou et al.2005）。小膠質(zhì)細胞的激活對神經(jīng)系統(tǒng)而言是把雙刃劍，既能對通過消除外來物質(zhì)對神經(jīng)系統(tǒng)所造成的傷害，也能因為過度激活產(chǎn)生過多的炎癥因子對神經(jīng)系統(tǒng)造成損害。如激活的小膠質(zhì)細胞可以分泌髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO），其可以催化過氧化氫形成更高神經(jīng)毒性的次氯酸（HClO），并進一步導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的組織損傷和病灶的炎癥反應(yīng)加劇 （Lefkowitz and Lefkowitz 2008）。

小膠質(zhì)細胞的激活、炎癥反應(yīng)、凋亡過程均與線粒體功能有關(guān)。如 1.1.3.5 和 1.1.3.6所述，線粒體是調(diào)控細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的中心：線粒體依賴的凋亡信號通路通過細胞色素 c 的釋放和 caspase 通路激活下游的凋亡進程；線粒體調(diào)控著炎癥因子的表達、炎癥小體的形成，以及與炎癥相關(guān)的通路信號分子 NF　B、MAPK 等。所以在檢測外源物質(zhì)對小膠質(zhì)細胞激活狀態(tài)、凋亡進程的影響時，線粒體的功能是重要的生理指標(biāo)。

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2.2 研究內(nèi)容
（1）研究丙烯酰胺對大鼠原代神經(jīng)小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)小膠質(zhì)細胞系 BV2 細胞的毒性；
（2）研究丙烯酰胺誘導(dǎo)的線粒體功能失活與細胞生存/死亡信號通路之間的聯(lián)系；

（3）研究丙烯酰胺對 BV2 細胞炎癥反應(yīng)的影響。

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2.3 材料與方法
2.3.1 細胞株
原代小膠質(zhì)細胞分離自 SD 大鼠，分離方法簡述如下：
處死大鼠后迅速分離腦組織后并置于冰浴的 HBSS 溶液中。剝離皮層部分，在胰酶的消化下，反復(fù)用玻璃棒研磨以分離膠質(zhì)細胞。細胞在經(jīng)過濾后，置于多聚賴氨酸預(yù)先鋪好的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基為含 20% FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。第一周隔天換液，第二周每周換兩次液。兩到三周后待細胞完全貼壁后，將培養(yǎng)瓶置于振蕩器上連續(xù)震蕩 4 h，上層懸液震搖下的即為原代小膠質(zhì)細胞，仍然貼壁的為星形膠質(zhì)細胞等其他膠質(zhì)細胞。（可以通過后續(xù)的 GFAP 和 OX-42 染色分別區(qū)分星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞）
BV2 細胞（小鼠小膠質(zhì)細胞系），購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫, 培養(yǎng)基為含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 5% CO2、37°C。
2.3.2 主要試劑
丙烯酰胺（Acrylamide,ACR）、3（-4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、溴化乙錠（EB）、吖啶橙（AO），蛋白酶抑制劑/去磷酸化酶抑制劑（protease/phosphataseinhibitor cocktail）均購自美國 Sigma-Aldrich 公司；

線粒體膜電位探針 JC-1，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 購自中國江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。

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第三章 丙烯酰胺對 BV2 神經(jīng)小膠質(zhì)細胞線粒體能量代謝及氧化還原狀態(tài)的影響 ....56
3.1 引言.........................................................56
3.2 研究內(nèi)容................................................... 56
3.3 材料與方法................................................. 56
第四章 芝麻酚誘導(dǎo) HepG2 人肝癌細胞凋亡與線粒體調(diào)控機制 ..........72
4.1 引言........................................................ 72
4.2 研究內(nèi)容.................................................... 72
第五章 芝麻酚對 HepG2 人肝癌細胞自噬的影響及線粒體的參與機制 ......85
5.1 研究背景.................................................... 85
5.1.1 自噬....................................................... 85

5.1.2 細胞自噬對凋亡的影響...................................... 85

第六章 芝麻酚與 DNA結(jié)合作用的研究

6.1 研究背景及目的
6.1.1 研究背景
天然小分子與生物大分子之間的相互作用是天然產(chǎn)物化學(xué)、食品營養(yǎng)、藥理學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科交叉領(lǐng)域的熱點課題。研究與蛋白質(zhì)、核酸等生物的相互作用，對探索功能性小分子在機體內(nèi)的儲存、運輸、作用機制具有重要意義。
DNA 分子結(jié)構(gòu)中由平行堆積的堿基、聚合的陰離子磷酸骨架以及兩條核苷酸鏈形成的溝區(qū)，是許多活性小分子的識別位點。小分子與 DNA 主要通過共價鍵、非共價鍵及剪切作用發(fā)生結(jié)合，其中大部分是以非共價鍵方式發(fā)生相互作用的。非共價結(jié)合主要通過三種作用模式（Kumar and Asuncion 1993）：（1）與荷負電的核糖-磷酸結(jié)構(gòu)的靜電結(jié)合作用；（2）與 DNA 溝區(qū)的作用；（3）嵌入到 DNA 堆積的堿基對之間。此外，還存在氫鍵、范德華力、疏水作用、瞬時偶極等較弱的作用力，這些作用力一起維系著DNA 特有的各種活性結(jié)構(gòu)。許多具有抗癌、抗病毒等活性的小分子物質(zhì)在生物體內(nèi)的靶目標(biāo)都是 DNA，它們通過與 DNA 結(jié)合，干擾 DNA 的復(fù)制和 RNA 的合成，，使腫瘤、病毒細胞遭受破壞（Montaner et al. 2005）�？梢姡ㄟ^深入研究小分子物質(zhì)與 DNA 作用，不僅有助于從分子水平上理解 DNA 的結(jié)構(gòu)特性、基因突變、疾病的來源、天然小分子的抗癌、抗病毒的作用機制、活性物質(zhì)和小分子物質(zhì)的體外篩選等方面都具有重要的意義。
6.1.2 研究的目的和意義

芝麻酚作為一種具有抗癌活性的小分子物質(zhì)，其與 DNA 的作用機制尚不明確。本研究利用光譜法和分子模擬研究芝麻酚與 DNA 分子相互作用的類型、作用力，以揭示芝麻酚生物功效的分子機制。研究主要應(yīng)用紫外與熒光光譜法研究了芝麻酚和 DNA 相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、結(jié)合力及結(jié)合距離、淬滅機理等各種信息，利用圓二色譜、紅外光譜及分子模擬研究芝麻酚和 DNA 相互作用的結(jié)合模式。這對于臨床使用劑量及了解小分子的作用過程具有重要的意義。小分子與 DNA 結(jié)合的研究報道較少，目前也尚未有關(guān)于芝麻酚與 DNA 結(jié)合作用機理的研究，從結(jié)構(gòu)變化合理地闡釋了結(jié)合方式，這將對藥物的合成與應(yīng)用提供有價值的理論指導(dǎo)。

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第七章 結(jié)論、創(chuàng)新點與展望

7.1 主要研究結(jié)論
本文以食品危害物丙烯酰胺和食品功能因子芝麻酚為研究對象，系統(tǒng)研究了兩者對細胞內(nèi)線粒體依賴性凋亡通路、線粒體能量代謝過程、氧化還原敏感的信號通路、線粒體自噬等相關(guān)的生理過程的影響。本文的研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
（1）丙烯酰胺可顯著抑制 BV2 神經(jīng)小膠質(zhì)細胞系的細胞活力，并具有濃度依賴性。并且丙烯酰胺可誘導(dǎo) BV2 細胞和大鼠原代細胞發(fā)生凋亡；進一步的試驗表明，丙烯酰胺降低了線粒體膜電勢和 Bcl-2/Bax 比值，增加了細胞色素 c 的釋放，激活 caspase 通路，進而激活了線粒體依賴的內(nèi)源性細胞凋亡通路。丙烯酰胺可通過調(diào)控 BV2 細胞內(nèi)對氧化還原敏感的信號通路及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，進而影響細胞的增殖、炎癥與凋亡。丙烯酰胺抑制了細胞存活信號蛋白 Akt 的磷酸化，激活了細胞死亡和炎癥信號 JNK 和 p38；丙烯酰胺增加了炎癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 NF　B 及其下游誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，進而增加了細胞 NO 的產(chǎn)量，表明丙烯酰胺具有促進炎癥反應(yīng)的作用；此外，丙烯酰胺處理增加了與細胞氧化還原相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Nrf2 的表達，但并未促進其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。

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參考文獻（略）

本文編號：98571