第一章 文獻(xiàn)綜述

1.1 研究背景和意義
小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕Z食作物之一，在我國，小麥作為第二大作物，其種植面積和產(chǎn)量僅次于水稻。我國小麥的年產(chǎn)量呈逐年遞增趨勢，2011 年小麥年產(chǎn)量 11740.09 萬噸，2012 年小麥年產(chǎn)量 12102.36 萬噸，2013 年小麥年產(chǎn)量 12192.64 萬噸，2014 年小麥年產(chǎn)量 12620.84 萬噸。2014 年與 2011 年相比小麥的年產(chǎn)量增加了近 8%。（數(shù)據(jù)來自國家統(tǒng)計(jì)局）。面制品的主要原料之一是小麥，全球大約三分之一的人口是以面制品為主食，它為人類攝取蛋白質(zhì)提供大量來源，遠(yuǎn)高于其它糧食作物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界小麥蛋白質(zhì)數(shù)量等于肉、蛋、奶蛋白質(zhì)的總和。但是小麥蛋白中缺乏賴氨酸，因此在小麥粉中添加賴氨酸含量高的蛋白質(zhì)可以提高小麥粉中蛋白質(zhì)含量，并平衡小麥蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量，提高小麥蛋白的營養(yǎng)價(jià)值。

大豆蛋白質(zhì)必需氨基酸含量高，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。大豆是主要的豆類作物之一，2010～2014 年大豆、綠豆、紅小豆及豆類總年產(chǎn)量如圖 1-1（數(shù)據(jù)來自國家統(tǒng)計(jì)局），由圖 1-1 可以看出，在我國大豆年產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠豆及紅小豆，居豆類之首。大豆?jié)饪s蛋白、大豆分離蛋白、蛋白粉、大豆酶解蛋白等（統(tǒng)稱大豆蛋白）是以大豆為原料制備的，而食品工業(yè)中，如乳品、飲料、面制品、肉制品、面制品等的生產(chǎn)均離不開大豆蛋白�，F(xiàn)如今，人口迅速膨脹而耕地面積大大減少的嚴(yán)峻形勢下，人們對(duì)大豆蛋白這種具有高營養(yǎng)、高產(chǎn)量的植物原料蛋白質(zhì)引起廣泛關(guān)注。大豆蛋白加工在我國已呈現(xiàn)迅猛發(fā)展態(tài)勢，其中大豆食品蛋白加工出口量占世界市場的 50%。據(jù)專家估計(jì)，全球?qū)Υ蠖沟鞍椎南M(fèi)量將會(huì)持續(xù)上升。以我國為例，2012 年實(shí)際消費(fèi)大豆 6400萬噸，占全球?qū)嶋H消費(fèi)的 25%。用于食品加工的國產(chǎn)大豆總量超過 1000 萬噸，其中 30%用于大豆分離蛋白生產(chǎn)，年產(chǎn)量達(dá) 70 萬噸(韓飛等 2013)。國內(nèi)市場上，多數(shù)肉制品的生產(chǎn)加工過程會(huì)添加大豆蛋白，而我國肉類年產(chǎn)量高達(dá) 7000 萬噸，約占世界肉類總量的 30%，但是深加工比率僅有 4%～5%，遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家的 50%～70%，隨著科技的發(fā)展，肉制品的深加工水平不斷提高，大豆蛋白的需求也日益凸顯，按 30%的肉制品深加工產(chǎn)品比率計(jì)，國內(nèi)大豆蛋白年需求量達(dá) 30 萬噸，2014 年全球大豆蛋白年需求量在 150萬噸～200 萬噸，初步估算，大豆蛋白年需求量會(huì)以每年 10%～15%的速度遞增（韓錦等 2014）。國際市場上，大多包裝食品生產(chǎn)中也有大豆蛋白的應(yīng)用。目前在食品生產(chǎn)工業(yè)上，我國已向 100 多個(gè)國家出口大豆蛋白。大豆蛋白具有的多種功能特性與產(chǎn)品質(zhì)量有直接影響，當(dāng)大豆蛋白和其它食品原料搭配使用時(shí)，可以使其營養(yǎng)價(jià)值得到顯著的改善，此外，它對(duì)于改善加工食品的質(zhì)構(gòu)特性也具有重要影響(Gan et al. 2009, López et al.2012, Mohsen et al. 2009)。目前，學(xué)者們主要對(duì)大豆蛋白的精深加工進(jìn)行深入研究，旨在開發(fā)一種具有更高的附加值、應(yīng)用價(jià)值的大豆蛋白產(chǎn)品。

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1.2 國內(nèi)外研究進(jìn)展
1.2.1 小麥蛋白質(zhì)概述

小麥一般含有 9%～13%的蛋白質(zhì)，小麥蛋白質(zhì)是人們?nèi)粘Ｊ澄锏鞍踪|(zhì)的主要來源。通常將小麥蛋白質(zhì)分為面筋蛋白（一般大約占小麥蛋白總量的 85%）和非面筋蛋白（一般大約占小麥蛋白總量的 15%）（Veraverbeke et al. 2002）。在生面團(tuán)中能形成網(wǎng)絡(luò)的蛋白稱為面筋蛋白，生面團(tuán)的粘彈性由面筋蛋白質(zhì)決定(Wang et al. 2014)。小麥蛋白質(zhì)的分類分布狀態(tài)如圖 1-2 所示。人畜必需氨基酸與小麥必需氨基酸含量如表 1-1。

1.2.1.1 面筋蛋白
根據(jù)水洗程度的不同，干物質(zhì)包含 75%～85%的蛋白質(zhì)和 5%～10%的脂質(zhì)，剩余物中大部分為淀粉和非淀粉類的碳水化合物。在實(shí)際中，“面筋”是指蛋白質(zhì)，也叫面筋蛋白。因?yàn)樗鼈儧Q定了小麥粉的焙烤特性，賦予小麥粉生面團(tuán)吸水性、結(jié)合性、粘性和彈性。面筋蛋白與非面筋蛋白不同，其在水或者稀鹽溶液中具有較低的溶解性。導(dǎo)致其低溶解性的主要因素為可電離的氨基酸側(cè)鏈含量低，非極性氨基酸和谷氨酸鹽的含量高，而非極性氨基酸和谷氨酸鹽很容易與水形成氫鍵。因此，使谷蛋白完全溶解而不影響其內(nèi)部結(jié)構(gòu)顯然是不可能的。
面筋蛋白包含幾百種蛋白質(zhì)組分，它們以單體或者通過鏈間二硫鍵連接形成的低分子或高分子聚合物存在（Wrigley et al. 1988）。根據(jù)不同的氨基酸組成，它們具有不同的特性，其組成特點(diǎn)為谷氨酸鹽和脯氨酸含量高而帶有其它官能團(tuán)氨基酸含量低。天然面筋蛋白質(zhì)的分子量甚至超過 20000KDa。習(xí)慣上，根據(jù)它們?cè)诰凭芤海ɡ纾?0%的乙醇）中的溶解度，大致將面筋蛋白分為可溶的麥醇溶蛋白和不可溶的麥谷蛋白。麥醇溶蛋白的含量為小麥蛋白總量的 40%～50%,麥谷蛋白的含量為小麥蛋白總量的30%～40%。由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測得麥醇溶蛋白單體的分子量為30KDa～80KDa (MacRitchie et al. 1990)，，麥谷蛋白聚合物的不均勻混合物分子量范圍在80KDa 至幾千 KDa (Masci et al. 2002)。
（1）麥醇溶蛋白

大部分麥醇溶蛋白以單體形式存在，在低 pH 條件下進(jìn)行凝膠電泳，以遷移速率為基礎(chǔ)，最初將它們分為四組（α-，β-，γ-，ω-麥醇溶蛋白），其遷移速率依次減小。后來，對(duì)氨基酸研究結(jié)果表明，分子的遷移速率不總能反映蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，也不一定能反映 α-，β-麥醇溶蛋白的分組(α/β-類型)�，F(xiàn)今的研究方法，例如二維電泳法或反相高效液相法(RP-HPLC)能夠?qū)Ⅺ湸既艿鞍追譃橐话俣鄠�(gè)組分�；趯�(duì)完整和部分氨基酸的研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)氨基酸組成和分子質(zhì)量，可以將它們分為四種不同類型：ω5-，ω1,2-，α/β-和 γ-麥醇溶蛋白(Wieser 1996)。

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第二章 大豆 7S 和 11S 球蛋白的提純及鑒定

2.1 前言
大豆是重要的植物蛋白質(zhì)資源之一，與谷類作物蛋白相比，大豆具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸平衡性好，以及乳化性、凝膠性、吸油性等優(yōu)良的功能特性而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和動(dòng)物飼料等多個(gè)領(lǐng)域。低溫豆粕蛋白含量達(dá) 45％～52％，低溫豆粕中蛋白質(zhì)變性程度小，大多大豆蛋白產(chǎn)品都是以低溫豆粕為原料制得的，因此其具有較高的開發(fā)利用價(jià)值（劉中華和曾維麗 2011）。7S 和 11S 是大豆蛋白的兩個(gè)主要組分，7S 的等電點(diǎn) 4.8左右，11S 的等電點(diǎn) 6.4 左右。目前主要是根據(jù)此原理對(duì)大豆中 7S 和 11S 組分（本文如無特殊說明 7S 和 11S 均指大豆中的組分）進(jìn)行分離。7S 和 11S 的分離方法應(yīng)用最多的是 Thanh 法（Thanh et al. 1975）和 Nagano 法（Nagano et al. 1992）。許多研究者都采用這兩種方法制備 7S 和 11S 組分（李成賢 2007；徐君 2009；黃行健 2010；朱曉燁等2011；宋佳等 2013；Tarone et al. 2013；Teng et al. 2009）。這些研究分別針對(duì) 7S 和 11S組分的得率、蛋白質(zhì)含量或者純度進(jìn)行了大量提取，但同時(shí)考慮得率和純度的分離純化技術(shù)研究較少。

鑒定蛋白質(zhì)純度的方法有多種，如 SDS-PAGE 電泳法、N-末端氨基酸殘基分析、等電聚焦電泳法和高效液相法等。由于許多蛋白質(zhì)的性質(zhì)相似，控制一個(gè)條件將兩個(gè)蛋白質(zhì)分開的可能性較小，因此，單獨(dú)采用任何一種分離鑒定的方法都不能完全確保蛋白質(zhì)的純度，必須同時(shí)選取 2～3 種不同的純度鑒定方法才能確定（田琨 2010）。本研究以脫脂豆粉為原材料，優(yōu)化了 7S 和 11S 的提取方法，同時(shí)分析 7S 和 11S 的提取率和純度，以期提高兩組分得率和純度。采用 SE-HPLC 和 SDS-PAGE 法對(duì) 7S 和11S 的純度及亞基分子量進(jìn)行分析，并和標(biāo)品進(jìn)行對(duì)照。最終確定適合本試驗(yàn)的 7S 和11S 提取方法。這對(duì) 7S 和 11S 的應(yīng)用及與其它成分之間的相互作用具有重要意義。

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2.2 材料與方法
2.2.1 材料和試劑

脫脂豆粉（TSF）蛋白質(zhì)含量 54.2%：鄭州同創(chuàng)益生食品有限公司；甘油（丙三醇）；乙醇；冰醋酸；95%乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；電泳凝膠配制試劑盒：博士德生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán) R-250：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；SDS：天津市光復(fù)精密化工；鹽酸：洛陽市昊華；三氨基甲烷（Tris）：上海市山浦化工有限公司；甘氨酸（氨基乙酸）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；AP（過硫酸銨）：洛陽市化學(xué)試劑廠；15 - 600 kDa 蛋白標(biāo)品：Sigma，808541，色譜級(jí)；大豆 7S 球蛋白標(biāo)品：Sigma，C5868，色譜級(jí)；大豆 11S 球蛋白標(biāo)品：Sigma，G3171，色譜級(jí)�；瘜W(xué)試劑均購自鄭州新風(fēng)化學(xué)試劑有限公司，為分析純。

2.2.2 儀器與設(shè)備

HMS-3C 型精密酸度計(jì)：臺(tái)州市新恩精密糧儀器有限公司；GL-20C 型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；D-37520 型高速冷凍離心機(jī)：德國 Kendro 公司；2300K 全自動(dòng)凱氏定氮儀：瑞典 FOSS TECATOR 公司；AY120 型分析天平：島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；DDY-6D 型電泳儀：北京市六一儀器廠；1200 高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司（中國）；SEC G4000SW 高效排阻液相色譜柱：日本 TSK 公司。
2.2.3 試驗(yàn)方法

11S 的提取中，沉淀 pH 及 4℃ 放置時(shí)間是影響 11S 得率及純度的主要因素（Denget al. 2012）。本試驗(yàn)通過調(diào)節(jié)沉淀 pH（6.2、6.3、6.4、6.5、6.6）及 4℃ 放置時(shí)間（8 h、10 h、12 h、14 h、16h）來研究其對(duì) 11S 提取的影響。7S 的提取中，關(guān)鍵在于除去 11S和中間組分，但有研究表明，α 和 α'的等電點(diǎn)分別為 5.2 和 5.3，在分離出 11S 后調(diào) pH5.0會(huì)使部分 α 和 α' 亞基沉淀為中間產(chǎn)物而損失（Hou and Chen 2008）。因此本試驗(yàn)擬提高除去中間產(chǎn)物時(shí)的 pH（5.2、5.3、5.4、5.5、5.6），以期在不影響 7S 純度的基礎(chǔ)上提高 7S 的得率。7S 和 11S 的提取流程參照文獻(xiàn)并作修改（Liu et al. 2007），如圖 2-1 所示。

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第三章 大豆 7S、11S 球蛋白與分離蛋白對(duì)面團(tuán)特性的影響規(guī)律研究........40
3.1 前言............................................................. 40
3.2 材料與方法.................................................... 41
3.2.1 材料和試劑................................................... 41
第四章 大豆 7S、11S 球蛋白與分離蛋白對(duì)饅頭品質(zhì)特性的影響規(guī)律研究......66
4.1 前言.............................................................. 66
4.2 材料與方法........................................................ 67
4.2.1 材料和試劑...................................................... 67
第五章 大豆 7S、11S 球蛋白與分離蛋白對(duì)小麥蛋白作用機(jī)理研究..............81
5.1 前言................................................................ 81

5.2 材料與方法...................................................... 81

第五章 大豆 7S、11S 球蛋白與分離蛋白對(duì)小麥蛋白作用機(jī)理研究

5.1 前言
在生產(chǎn)和消費(fèi)中小麥?zhǔn)亲钪匾墓任镏�。食物蛋白質(zhì)的氨基酸組成中，如果某一氨基酸缺乏，將影響整體蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，如：小麥蛋白質(zhì)中缺少賴氨酸(Martínez-Villaluenga et al. 2010)。為了增加面制品中氨基酸的平衡，可以在面制品中添加大豆蛋白(Roccia et al. 2009; Wilson et al. 2007)。但是眾所周知，小麥-大豆復(fù)合配會(huì)降低面團(tuán)的品質(zhì)，還會(huì)使其焙烤性變差(Gupta et al. 2011; Mohammed et al. 2014; Ribotta etal. 2005)。大豆蛋白不利于面團(tuán)形成。這主要是由于大豆蛋白和小麥蛋白之間的差異造成的，如水溶性、一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同和粒度分布等。面團(tuán)的粘彈性是小麥蛋白特有的。面團(tuán)混合時(shí)大豆蛋白和面筋蛋白會(huì)發(fā)生相互作用。研究大豆蛋白和小麥蛋白之間的相互作用有利于深入了解如何降低面團(tuán)中的大豆蛋白對(duì)面團(tuán)的弱化效應(yīng)。
先前的研究認(rèn)為大豆蛋白對(duì)面團(tuán)形成的負(fù)作用主要是由于大豆蛋白與小麥面筋蛋白之間相互交聯(lián)太少(Ryan et al. 2002b)。最近關(guān)于大豆蛋白與小麥蛋白之間相互作用的研究成為熱點(diǎn)（Don et al. 2005; Ribotta et al. 2005）。一些研究者發(fā)現(xiàn)大豆蛋白與小麥蛋白之間是通過非共價(jià)鍵相互作用的，因?yàn)橥ㄟ^對(duì)面團(tuán)和小麥-大豆復(fù)合面團(tuán)中的巰基進(jìn)行分析，并沒有發(fā)現(xiàn)有所改變。其他人認(rèn)為大豆蛋白和小麥蛋白通過非共價(jià)鍵和共價(jià)鍵（二硫鍵）相互作用，而且作用程度取決于大豆蛋白形態(tài)(Ribotta et al. 2005)。盡管這些研究對(duì)于理解大豆-小麥面團(tuán)所產(chǎn)生的一些物理、化學(xué)及流變學(xué)特性的改變起到了一定的作用。然而大豆蛋白與小麥蛋白在分子層面的研究還較少，7S 和 11S 是大豆蛋白的主要組分，關(guān)于提純后的 7S 或 11S 與小麥蛋白作用的研究尚未見報(bào)道。在本論文第三章的研究中，發(fā)現(xiàn) 11S 或 7S 會(huì)影響面筋的形成并弱化面團(tuán)。這為研究 7S 或 11S 與小麥蛋白作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

本章采用 NMR 分析 7S、11S、SPI 對(duì)水分遷移特性的影響，通過紫外、SE-HPLC、SDS-PAGE 研究 7S、11S、SPI 與小麥蛋白之間的作用機(jī)理。深入探討大豆蛋白及其組分與小麥蛋白之間作用的分子機(jī)理，以期找到加入大豆蛋白降低面制品品質(zhì)的原因，從而為大豆蛋白在面制品中應(yīng)用和改良提供理論基礎(chǔ)，拓寬大豆蛋白在面制品中的應(yīng)用。

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第六章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望

隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，對(duì)傳統(tǒng)面制品不僅從營養(yǎng)，從功能和品質(zhì)上的要求也越來越高。將大豆蛋白添加到面制食品中應(yīng)用，既增加了蛋白質(zhì)含量，又提高了蛋白質(zhì)營養(yǎng)質(zhì)量。因此，將大豆蛋白產(chǎn)品添加到面制品中是今后的發(fā)展趨勢。本論文目的是研究 7S、11S、大豆分離蛋白對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性及饅頭品質(zhì)的影響規(guī)律及 7S、11S、大豆分離蛋白對(duì)小麥蛋白的作用機(jī)理，為大豆蛋白在面制品中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，對(duì)改善面制食品的營養(yǎng)、加工品質(zhì)、擴(kuò)大大豆蛋白在面制食品加工中的應(yīng)用范圍等都有較大意義，因而具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。內(nèi)容主要包括以下三個(gè)方面：首先以脫脂豆粉為原料，對(duì)大豆蛋白的主要組分（7S 和 11S）進(jìn)行提純和鑒定，為后續(xù)試驗(yàn)奠定原料基礎(chǔ)；其次將大豆分離蛋白加入到不同種類的小麥粉中，研究其對(duì)混合粉面團(tuán)特性及饅頭品質(zhì)特性的影響規(guī)律，分析大豆分離蛋白對(duì)混合粉面團(tuán)特性及饅頭品質(zhì)特性的影響規(guī)律與小麥粉品質(zhì)的相關(guān)性，并探討加入大豆分離蛋白后混合粉的面團(tuán)特性與饅頭品質(zhì)特性各指標(biāo)的相關(guān)性。將提純后的 7S 和 11S 添加到小麥粉中與之混合，比較其對(duì)小麥粉面團(tuán)的流變學(xué)特性及饅頭品質(zhì)特性的影響，為深入研究其對(duì)小麥蛋白作用的機(jī)理打下基礎(chǔ)；最后研究 7S、11S、大豆分離蛋白對(duì)小麥蛋白作用機(jī)理。以下為本研究的主要結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)；同時(shí)，對(duì)相關(guān)研究的發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

6.1 結(jié)論
6.1.1 大豆7S和11S球蛋白的提純及鑒定

首先，對(duì) SE-HPLC 的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的色譜條件為：洗脫液（水/乙腈）70/30，洗脫液流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 10μL。根據(jù)優(yōu)化的色譜條件對(duì) 7S 和 11S標(biāo)品進(jìn)行采樣，以 10 倍信噪比確定定量限，得到 7S（y=299.59x+3.7712，R2=0.9792）和 11S（y=197.08x+4.1485，R2=0.9861）純度分析標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可以用于 7S 和 11S 純度的分析。同時(shí)以提取率和純度為定量指標(biāo)確定 7S 和 11S 提純的最佳工藝參數(shù)（11S 的沉淀 pH 值為 6.4、11S 靜置時(shí)間為 12 h、7S 的沉淀 pH 值為 5.4），在此條件下提純 7S 和 11S 的得率分別為 20.9%和 17.3%，7S 和 11S 的純度分別達(dá)到 86.3%和 92.0%。其次，采用 SE-HPLC 法分析 7S 和 11S 的分子量，分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Log(M)=-0.2221x+3.8789，決定系數(shù)為 R2=0.9969。將所提純的 7S 和 11S 樣品的分子量與 7S 和 11S 標(biāo)品分子量進(jìn)行比對(duì)，表明所提純樣品為 7S 和 11S，能被后續(xù)試驗(yàn)所用。最后采用 SDS-PAGE 法進(jìn)一步驗(yàn)證了 7S 和 11S 分子亞基的分子量，并用凝膠分析軟件對(duì) 7S 和 11S 的純度進(jìn)行分析，并和 SE-HPLC 法測的純度比較，進(jìn)一步驗(yàn)證所得 7S 和11S 的純度。為后續(xù)試驗(yàn)奠定了原料基礎(chǔ)。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：84421