第二章 三種人參屬植物 HPLC 代謝圖譜的研究

2.1 引言

在發(fā)展中國家包括越南和中國的經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)，正確的識(shí)別中藥和尋求促進(jìn)中藥的合理使用對(duì)保證中藥材的質(zhì)量是至關(guān)重要的。事實(shí)上，這些地區(qū)很少種植中藥材，所有的中藥材都是通過自然植被獲得的，因此，誤認(rèn)和摻假經(jīng)常發(fā)生。但是，目前并沒有相關(guān)報(bào)道顯示如何識(shí)別和辨別這三種人參屬植物。本研究的目的是利用更加合適的條件建立一套可行的 HPLC 方法，基于該 HPLC 方法，我們建立這三種人參屬植物的指紋圖譜來識(shí)別和鑒別這三種植物。此外，在指紋圖譜的基礎(chǔ)上，應(yīng)用相似性分析（Similarityanalysis）、聚類分析（Hierarchical clustering analysis）和主成分分析（Principal componentanalysis）等化學(xué)計(jì)量法來研究這三個(gè)物種及其樣品間的關(guān)系。

2.2 材料、試劑與儀器

26 個(gè)植物材料均收集或購買于東南亞的不同地區(qū)（表 2-1），45℃下烘干。所有的材料均由云南省文山州三七研究院陳中堅(jiān)研究員鑒定。通常情況下，三七的種植需要一年的時(shí)間來育苗，之后從苗床移栽到田地，最終兩年之后被采收。三七的樣品由不同肥料處理和不同年限采收的材料組成，其中，，不同肥料處理一年的樣品 S1~S16（表 2-2）試驗(yàn)在云南省文山州苗鄉(xiāng)三七科技示范園（23°32' N, 104°19' E, 海拔 1500 m）完成，每個(gè)處理取 5 株三七作為試驗(yàn)材料。此外，所有的樣品分別用小型粉碎機(jī)粉碎成粉末并過200 目的篩子。

第三章 三種人參屬植物揮發(fā)油成分的比較.....37

3.1 引言 ......37
3.2 材料、試劑與儀器.....37
3.3 方法....38
第四章 三種人參屬植物的遺傳多樣性及其遺傳距離....47
4.1 引言.....47
4.2 材料、試劑與儀器......48
4.3 方法 ...49
第五章 三七不同部位主要成分的研究........58
5.1 引言....58
5.2 材料、試劑與儀器.......59
5.3 方法.......60

第八章 三七中皂苷合成關(guān)鍵酶基因的原核表達(dá)研究

8.1 引言

植物體中絕大多數(shù)蛋白酶的含量極低，為了進(jìn)一步研究各種酶的蛋白結(jié)構(gòu)及其體外活性等，我們需要高含量的蛋白作為研究材料。原核表達(dá)可以通過將外源目的基因連接到特定的表達(dá)載體中并導(dǎo)入表達(dá)菌株的方法，在特定原核生物或細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)。原核表達(dá)具有操作簡單、快捷、需時(shí)較短、表達(dá)產(chǎn)量高和適合工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。目前，原核表達(dá)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種藥用植物次生代謝關(guān)鍵酶基因的研究中，并在大腸桿菌等菌株中得到了大量表達(dá) (常立等 2014; 胡薇等 2012; 陶韻文等 2014)。為了得到三七中皂苷合成的關(guān)鍵酶，我們?cè)诒菊鹿?jié)中構(gòu)建了三七中皂苷合成關(guān)鍵酶基因的原核表達(dá)體系，這將為獲得三七中皂苷合成幾種關(guān)鍵酶提供了有效途徑，并為其體外酶活試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

8.2 材料、試劑與儀器

為了鑒定誘導(dǎo)出來的蛋白是包涵體還是可溶性蛋白，需要對(duì)菌體進(jìn)行破碎，具體操作步驟如下：1. 取 8.3.12 中活化后的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用終濃度為 0.6 mM 的 IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，根據(jù)摸索出的最佳誘導(dǎo)時(shí)間收取菌液；2. 用 50 mL 的離心管收集菌液，在 4℃，8000 rpm 下離心 3 min。倒掉上清，加入 40 mL的 ddH2O 洗一遍，4℃，12,000 rpm 離心 2 min；3. 倒掉上清，用適量的 PBS 懸浮菌液（每克 10mL）；4. 用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎機(jī)對(duì)懸浮起來的菌體進(jìn)行破碎 3~5 次，破碎前后的菌液始終在冰水混合物中，這樣蛋白不易變性；5. 將破碎后的菌液在 4℃，7800 rpm 條件下離心 30 min；6. 將上清蛋白用 0.22 μm 濾膜過濾，沉淀部分用 PBS 緩沖液懸�。�7. 分別制備上清和沉淀的蛋白上樣液，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，通過觀察電泳結(jié)果，可以確定所誘導(dǎo)蛋白是包涵體還是可溶性蛋白。
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第九章 總結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)

本研究在 HPLC-PAD 基礎(chǔ)上，采用化學(xué)指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法，分別建立了三種人參屬植物的化學(xué)指紋圖譜，通過比較它們模擬中值色譜圖中的 22 個(gè)特征峰可以很容易將它們區(qū)分并辨認(rèn)；通過常用的化學(xué)計(jì)量法——相似性分析、聚類分析和主成分分析研究不同樣本之間的關(guān)系得出結(jié)論：越南三七和屏邊三七在皂苷成分上與三七相比具有更高的相似性，而三七在皂苷成分上具有更高的多樣性，不同的生長年限和肥料處理對(duì)三七中皂苷種類的影響極小。另一方面，本研究利用 GC-MS 分析比較了三種人參屬植物揮發(fā)油的成分，三個(gè)物種含有數(shù)量相似的化學(xué)成分（約 70 種），但是每種化合物的含量差異較大；三個(gè)物種的揮發(fā)油中共鑒定出了 120 種化合物，其中三個(gè)物種共有的化合物為 26 種，兩個(gè)物種共有的化合物為 31 種，三個(gè)物種揮發(fā)油的主要成分均是具有良好生物學(xué)活性的鐮葉芹醇；基于它們揮發(fā)油成分的聚類分析顯示，越南三七和屏邊三七在揮發(fā)油成分上具有更高的相似性。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：63481