第 1 章 緒論

奶產(chǎn)業(yè)是農(nóng)牧業(yè)的重要組成部分，同時奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展水平也是度量一個國家乃至畜牧業(yè)發(fā)展水平的重要標志。奶產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展對于改進城鄉(xiāng)居民的飲食結(jié)構(gòu)、增加農(nóng)民的經(jīng)濟收入、提高全民的身體素質(zhì)、促進農(nóng)村產(chǎn)業(yè)的結(jié)構(gòu)調(diào)整、帶動國民相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展等都具有十分重大的意義。通過各項研究表明，遺傳育種是提高奶牛生產(chǎn)效率的主要因素。由此可見，良種的選擇是奶業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，是奶業(yè)發(fā)展的根本動力。相對于國外的育種工作的發(fā)展，我國的育種工作開始的較晚。我國育種工作開始于 1985年，開始的標志是中國黑白花（后更名為中國荷斯坦牛）新品種的培育成功。雖然我國育種工作開展的晚，但是國家對于奶業(yè)的發(fā)展給予了很大力度的支持，尤其是“十一五”和“十二五”國家科技支撐計劃中給予奶業(yè)項目優(yōu)先安排。為了盡快擺脫奶業(yè)發(fā)展需求先于遺傳改良技術(shù)的局面，需要開展一系列的科研工作。分子數(shù)量遺傳學(xué)開始于 20 世紀 80 年代，它可以使科學(xué)研究者們從表型選擇到標記輔助選擇，最終實現(xiàn)分子育種的目標。目前，可以通過對基因型的選擇，實現(xiàn)對遺傳標記或重要經(jīng)濟性狀相關(guān)基因的鑒定，從而實現(xiàn)個體基因組的早期選擇[1]。

1.1 奶牛分子育種技術(shù)的研究進展

1.1.1 新疆奶牛飼養(yǎng)概況
據(jù)2014年中國奶業(yè)統(tǒng)計年鑒統(tǒng)計，2013年年底新疆奶牛存欄量為293.78萬頭，占全國奶牛存欄量的20%；奶類總產(chǎn)量為325.09 萬噸，占全國奶類總產(chǎn)量的0.9%；人均占有量為146.8 kg/人，其中城鎮(zhèn)居民奶制品消費量為35.6 kg/人[2]。據(jù)統(tǒng)計2013年，新疆地區(qū)有42個奶牛場共21576頭奶牛進行了生產(chǎn)性能測定，測定日平均產(chǎn)奶量是25.14 kg，平均乳脂率3.82%，平均乳蛋白率3.19%，平均體細胞數(shù)41.617萬個/mL。新疆奶牛以中國荷斯坦牛為主，中國荷斯坦牛存欄77萬頭，占新疆牛群總存欄量的33%[3]。由新疆奶牛存欄量和奶類總產(chǎn)量與全國存欄量和奶類總產(chǎn)量比值可知，新疆地區(qū)奶牛存欄量較高，但是其奶類總產(chǎn)量卻較低，同樣說明由于新疆地區(qū)奶牛生產(chǎn)性能低下，導(dǎo)致奶類總產(chǎn)量低下，需要通過分子育種等手段提高新疆地區(qū)奶牛的生產(chǎn)性能。
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1.2 奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因的研究進展
�；o酶A：甘油二酯�；D(zhuǎn)移酶1(acyl-CoA：diacylglycerol acyltransferase1，DGAT1)定位于 BAT14 上，是形成乳腺中甘油三酯的關(guān)鍵酶，它能夠促進甘油二酯和脂酰-CoA形成甘油三酯[6]。DGAT1 基因上的 K232A 位點由于不同的等位基因而形成不同的脂肪酸組分[7]。Schennink 等[8]發(fā)現(xiàn)了 DGAT1 基因上的等位基因 A 與很多不飽和脂肪酸的形成有關(guān)，等位基因 A 能夠增加 C18 和總不飽和脂肪酸的比率，同時減少飽和 C10，C12，C14 和 C16 的成分，而 DGAT1 基因上等位基因 K 的作用卻與此相反，因此，研究者們可以通過分子生物學(xué)手段對 DGAT1 不同基因型進行選擇從而達到改變牛奶脂肪酸組分、生產(chǎn)出更利于公眾健康的不飽和乳脂牛奶。Tantia 等[9]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)印度奶牛和水牛中 DGAT1 基因只存在等位基因 K，該等位基因?qū)θ橹�、乳脂量和乳蛋白率影響顯著。賈晉等[10]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) DGAT1 位點多態(tài)性對 305 d 產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白性狀影響顯著。張曉東等[11]發(fā)現(xiàn)DGAT1基因K232A位點具有多態(tài)性并對乳脂率有顯著影響，KA 基因型個體的乳脂率比 KK 基因型個體乳脂率低 0.16。盧振峰等[12]在三河牛 DGAT1基因的 K232A 位點多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)其 KK 基因型個體的體細胞分最低。因此在奶牛育種中，可以根據(jù)不同的育種目標和市場需要，利用 DGAT1 基因?qū)δ膛Ｈ后w進行標記輔助選擇。
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第 2 章 中國荷斯坦牛 SNPs 位點分析

2.1 混池重測序篩選 SNP
2.1.1 試驗材料
2.1.1.1 試驗動物
本研究混池所用試驗群體為 15 頭新疆地區(qū)中國荷斯坦牛，采用尾靜脈采血，EDTA-K2 抗凝，低溫帶回實驗室分裝后置于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?br />
2.1.1.2 主要試劑和溶液配置
（1）常用試劑D15000+2000（TIANGEN）、ddH2O、十二烷基硫酸鈉（SDS）、尿素、二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-NA·2H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、Nacl、瓊脂糖（Agrose）、Tris 飽和酚、Tris 堿、氯仿：異戊醇（24：1）、無水乙醇、溴化乙錠（EB）等購自新疆阜瑞克生物科技有限公司，大部分為進口分裝產(chǎn)品。End Repair Contril，End Repair Mix，AMpure XP Beads，Resuspension Buffer，A-Tailing Control，A-Tailing Index，Stop Ligation Buffer，1×TAE Buffer，凝膠純化試劑盒，PCR Primer Cocktail，PCR Master Mix，6×Loading Buffer，PiocGreen 熒光燃料等購自諾禾致源生物信息科技有限公司。
（2）常用溶液配制溶液配制均以雙蒸水為溶劑，溶液的配置參考《分子克隆實驗指南》第三版，溶液配置完成后使用高壓鍋滅菌。滅菌時間為 20 min。
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2.2 采用 MassArray 技術(shù)進行基因分型
本研究所用試驗群體來自于新疆呼圖壁種牛場、烏魯木齊種牛場和新疆天山畜牧生物有限公司，共計 1130 頭中國荷斯坦牛。試驗動物采用尾靜脈采血，EDTA- K2 抗凝，低溫帶回試驗室分裝后置于-20 ℃凍存?zhèn)溆�。根�?jù)已知 SNP 位點序列信息，使用 Sequenom MassARRAYAssay Design 軟件對待測 SNPs 進行引物設(shè)計，引物設(shè)計中包括 PCR 擴增引物和單堿基延伸引物。引物設(shè)計完成后經(jīng)軟件測試可以使用后交由生物公司進行引物合成。共設(shè)計 15 對引物，6 個 SNPs由 DNA 混池全基因組重測序結(jié)果提供，9 個 SNPs 由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)中國荷斯坦奶牛全基因篩選結(jié)果和最新研究結(jié)果提供。
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第 3 章 SNP 位點對中國荷斯坦牛產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)分析..........45
3.1 材料與方法......45
3.1.1 生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)收集.......45
3.1.2 數(shù)據(jù)整理.......45
3.1.3 因素水平劃分.......45
3.1.4 試驗統(tǒng)計軟件.......46
3.1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.......46
3.2 結(jié)果..........47
3.2.1 性狀表型記錄.......47
3.2.2 SNP 對產(chǎn)奶性狀的遺傳效應(yīng)分析...... 48
3.2.4 連鎖與單倍型分析.......54
3.2.5 單倍型對產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)分析.......55
3.3 討論..........56
3.3.1 SNPs 多態(tài)性驗證.........56
3.3.2 SNPs 對產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)分析.........57
3.3.3 連鎖不平衡分析...........59
3.3.4 單倍型分析...........59
3.3.4 SNP 基因型分析檢測平臺.......... 60
第 4 章 結(jié)論...... 61

第 3 章 SNP 位點對中國荷斯坦牛產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)分析

3.1 材料與方法
3.1.1 生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)收集

本試驗中所需的生產(chǎn)性能主要包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和體細胞數(shù)。生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)由自治區(qū)奶業(yè)辦公室乳品質(zhì)量檢測中心提供。取自 2011-2014 年間呼圖壁種牛場、烏魯木齊種牛場和天山畜牧生物有限公司中國荷斯坦牛的 DHI 測定數(shù)據(jù)。DHI 測定數(shù)據(jù)是每月從牛場采樣一次，自治區(qū)奶業(yè)辦公室乳品質(zhì)量檢測中心進行檢測所得結(jié)果，，主要檢測項目有乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體和體細胞數(shù)等，測定日產(chǎn)奶量由牛場測定記錄，報送檢測中心。中國荷斯坦牛每頭牛完整而詳細的胎次和日產(chǎn)奶量等數(shù)據(jù)資料來自該場的累積記錄和現(xiàn)場測量記錄，包括父號、母號、出生時間、產(chǎn)犢時間、305 d 產(chǎn)奶量及全期產(chǎn)奶量等。體細胞數(shù)的分布頻率為偏態(tài)分布，在統(tǒng)計分析中許多特性不能使用偏態(tài)分布數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析，因此需要將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，將偏態(tài)的體細胞數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)的體細胞分.場劃分按照自然場地進行劃分，烏魯木齊種牛場、天山畜牧生物有限公司和呼圖壁種牛場分別采用 1、2、3 代表；產(chǎn)犢年份按照自然年份進行劃分；按照新疆氣候的特點，將產(chǎn)犢季節(jié)分為冬(11-2 月)、春（3-5）夏(6-10 月)3 個季節(jié)，分別以數(shù)字 1、2、3 表示，劃分標準以李金國等[89]人研究結(jié)果為主，參考新疆近年來月平均氣溫進行季節(jié)的劃分.

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結(jié)論

本研究使用 DNA 混池全基因組重測序技術(shù)進行 SNPs 的篩選，同時使用 MassArray技術(shù)進行基因型分型，對已報道的 SNPs 在新疆地區(qū)中國荷斯坦牛的遺傳效應(yīng)進行功能驗證，對新發(fā)現(xiàn)的 SNPs 對產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)進行分析。得到以下結(jié)果：
1.通過 DNA 混池全基因組重測序得到大量的 SNPs，通過對 SNP 位點的篩選并根據(jù)MassArray 技術(shù)檢測要求，最終選取 6 個 SNPs 進行下一步分型試驗，6 個 SNPs 均屬于非同義變異，并屬于首次發(fā)現(xiàn)的 SNPs。
2.將由 MassArray 技術(shù)的到分型結(jié)果與產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)進行分析，發(fā)現(xiàn) 6 個 SNPs與產(chǎn)奶性狀有顯著影響，2 個 SNPs 與產(chǎn)奶性狀有極顯著影響。
3.采用 Haploview 軟件對 SNPs 進行連鎖及單倍型分析，共發(fā)現(xiàn) 3 個單倍型模塊，3個單倍型模塊間連鎖程度較低，不同的單倍型對產(chǎn)奶性狀均有顯著性影響。
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參考文獻(略)

本文編號：56307