第一章 文獻(xiàn)綜述

1.1 蘋果多酚概述
我國(guó)是蘋果的主產(chǎn)區(qū)，根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織 FAO 2014 年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國(guó)蘋果種植面積達(dá)到 222 萬公頃，年產(chǎn)量約 3850 萬噸，種植面積和年產(chǎn)量均占世界的一半，均居世界首位。中國(guó)蘋果有黃土高原、渤海灣、黃河故道和西南冷涼高地四大產(chǎn)區(qū)，根據(jù)氣候和生態(tài)適宜原則，西北黃土高原產(chǎn)區(qū)和渤海灣產(chǎn)區(qū)是中國(guó)最適合蘋果發(fā)展的產(chǎn)區(qū)，陜西省憑借地理優(yōu)勢(shì)，在種植面積、年產(chǎn)量和蘋果濃縮汁出口等方面均居全國(guó)前列。2012 年種植面積 1000 萬畝、年產(chǎn)量達(dá) 1000 萬噸。濃縮汁產(chǎn)量 50 萬噸，其中九成用于出口，產(chǎn)品銷往歐盟、北美、中東、日本等國(guó)家和地區(qū)。蘋果酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多糖（劉鐵錚等 2004）、脂肪、果膠（Schieber etal.2003）、粗纖維、鉀、鈣、磷和微量元素鋅、鐵（張莉等 2009）及維生素 B1、維生素 B2、維生素 C（Odriozola et al. 2007），還富含多種生物活性物質(zhì)，三萜類、甾醇、多酚等。
蘋果中所含多元酚類物質(zhì)通稱為蘋果多酚（Shaoji et al. 2004），分為中性酚和酚酸，主要的中性酚有根皮苷、根皮素、兒茶素、表兒茶素、原花青素類等，主要的酚酸有綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、P-香豆酸等（吳燕華等 2002）。Alonso-Salces 等（2004）運(yùn)用高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜及二極管陣列檢測(cè)的方法，在蘋果中檢測(cè)到多達(dá) 30 種多酚化合物及聚合體，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，蘋果多酚的主要成分包括黃酮醇類（槲皮苷配糖體）、黃烷-3 醇類、二氫查耳酮類（根皮苷配糖體）、花色苷類、羥基肉桂酸類等。蘋果多酚有多種生理功能，近年來，許多科研工作者發(fā)現(xiàn)蘋果多酚有極強(qiáng)的抗氧化活性（Biedrzycka andAmarowicz 2008；Lu and Yeap 2000），具有抗菌消炎（Chanwitheesuket al.2007; Sul et al. 2009; Jung et al. 2009）、預(yù)防冠心�。╓eichselbaum et al. 2010）、抗腫瘤（Selvaraju et al. 2007; Shao et al. 2011）、抗輻射（Chaudhary et al.2006）等多種藥理功能。

蘋果多酚的種類和含量因品種、部位、成熟度、環(huán)境等因素不同而有很大差異，杜中軍（2002）的試驗(yàn)結(jié)果表明在嘎拉蘋果品種的果皮中發(fā)現(xiàn)了花青素——山越橘苷，而金冠蘋果的果皮中沒有檢測(cè)到；金冠蘋果的果肉中含有槲皮苷，而嘎拉蘋果的果肉中卻沒有檢測(cè)到；金冠的根皮苷含量高于嘎拉。Tsao等（2003）研究發(fā)現(xiàn)果皮中單體和聚合的黃烷-3-醇占總酚的60%，黃酮醇占18%，羥基肉桂酸占9%，二氫查爾酮占8%，花青素占5%；果肉中原花青素占56%，羥基肉桂酸占40%，二氫查爾酮占4%。 ata 等（2009）研究發(fā)現(xiàn)蘋果50%的根皮苷存在于果皮中，而果皮只占全果重的6-8%，此外，其他的一些文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果（Alonso-Salces et al.2004; McGhie et al.2005; Veberic etal.2005; Petkov ek et al.2007）。而Hagen 等（2007）和Kondo 等（2002）發(fā)現(xiàn)在幼果期和采收前期果肉的原花青素B1、原花青素B2、綠原酸、兒茶素、表兒茶素含量比果皮高。唐傳核（2001）發(fā)現(xiàn)原花青素、兒茶素及綠原酸是成熟期蘋果的主要多酚，而二氫查耳酮、黃酮醇類化合物在未成熟蘋果中含量較多。Zhang 等（2010）發(fā)現(xiàn)蜜脆蘋果果肉中主要的多酚為原花青素 B1 (81.40 ± 3.72μg/gFW) 、原花青素 B2 (54.35 ± 2.54μg/g FW) 、綠原酸(52.93 ± 4.81μg/g FW) 、兒茶素(44.69 ±2.13μg/g FW)、表兒茶素(10.42 ± 0.68μg/g FW) 等。Dabrosca 等（2007）在研究 ‘Limoncella’（產(chǎn)自意大利）蘋果時(shí)，也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。

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1.2 根皮苷概述
根皮苷是蘋果多酚中最具代表性的一種多酚類成分，法國(guó)化學(xué)家于 1835 年從蘋果樹皮中分離得到（Ehrenkranz et al.2005）。它對(duì)蘋果及其產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤有重要的影響（Fromm et al.2012; Veitch et al.2008）。根皮苷具有多種生物活性，如可調(diào)節(jié)血壓、降低血糖（Wang et al.2007）、清除體內(nèi)自由基（Lu et al.2000）、保護(hù)心臟（Ehrenkranzet al.2005）、預(yù)防和治療糖尿病等（董華強(qiáng)和寧正祥 2006），已應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、組織培養(yǎng)、保健食品等方面（馮雪嬌 2008; Lavelli et al.2011; Ma et al.2012）。根皮苷作為特征多酚，也在蘋果汁質(zhì)量控制和鑒定中得到了應(yīng)用（蘇光明等 2010）。
1.2.1 根皮苷的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

根皮素（Phloretin）的 R1、R2、R3 和 R4 位被不同的基團(tuán)取代，形成各種衍生物，根皮苷是最重要的一種。根皮苷屬于植物黃酮類中的二氫查爾酮苷，是根皮素的葡萄糖苷，其分子骨架為 C6-C3-C6（兩個(gè)苯環(huán)通過一個(gè) C3鏈連接）結(jié)構(gòu)，在 2’位上連接一分子的 β-D-吡喃葡萄糖，結(jié)構(gòu)式如圖 1-1（引自 Gosch et al.2010a），分子式 C21H24O10，分子量：436.41。根皮苷溶于熱水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，不溶于醚、氯仿。

1.2.2 根皮苷在自然界的分布

糖基化是由糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase, GT, EC 2.4.x.y）催化的一種重要的翻譯后修飾過程。它通常是將核苷酸-糖供體中的單糖轉(zhuǎn)移到其他的碳水化合物、蛋白或脂上，形成糖苷鍵。植物常見的糖供體有尿苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖醛酸等。糖基化通過調(diào)節(jié)細(xì)胞重要代謝物的水平、活性和位置在植物自動(dòng)調(diào)節(jié)方面起重要作用。植物細(xì)胞的某些活性膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)只識(shí)別糖苷不識(shí)別苷元，通過糖基化增加化合物親水性改變其溶解性，使其通過該系統(tǒng)（Li et al.2001; Gachon et al.2005）。糖基化能增加化合物在植物細(xì)胞的穩(wěn)定性，促進(jìn)其貯存和積累（Jones and Vogt 2001; Bowles et al.2005）。同時(shí)，也是決定天然產(chǎn)物生物活性和生物利用度的重要因素之一（Ross et al.2001；Bowles et al.2006）。例如槲皮素，屬于黃酮類，一種有效的抗氧化劑，可以在不同位點(diǎn)被引入各種糖基，大約有 300 多種槲皮素糖苷，這些糖苷有不同的生物活性（Harborne and Baxter 1999）。又如，在柚皮素 7-O-葡萄糖苷的 2-OH 或 6-OH 引入一個(gè)鼠李糖能使葡萄柚變苦或使柑橘變得無味（Frydman et al.2004）。甜葉菊（Stevia rebaudiana）葉中含有的雙萜糖苷——甜菊苷和萊苞迪苷 A 是強(qiáng)力甜味劑，它們不同的糖基化形式?jīng)Q定其甜度（Richmanet al.2005）。此外，植物糖基轉(zhuǎn)移酶在外源物脫毒和調(diào)節(jié)激素活性方面也起重要作用。例如，擬南芥 UGT73C5 糖基化甾類激素和油菜素內(nèi)酯，降低其生物活性（Poppenbergeret al.2005）。

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第二章 蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆及原核表達(dá)

植物糖基化的作用是通過增加親水性改變苷元的溶解性，提供進(jìn)入膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的途徑，這種系統(tǒng)只能識(shí)別糖苷，而不能識(shí)別苷元。糖基化通過調(diào)節(jié)重要細(xì)胞代謝物的水平、活性和定位的功能在保持細(xì)胞內(nèi)平衡方面起到很大的作用。某些糖基化反應(yīng)參與植物體內(nèi)激素的平衡調(diào)節(jié)。另外糖基化還能降低或除去內(nèi)源和外源物質(zhì)的毒性。糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物特異性，故植物中含有多種糖基轉(zhuǎn)移酶，如甜葉菊苷糖基轉(zhuǎn)移酶（Fordet al.1998）、花青素糖基轉(zhuǎn)移酶（Ogata et al.2005）、染料木素糖基轉(zhuǎn)移酶（Sawada etal.2005）、查爾酮糖基轉(zhuǎn)移酶（Davies et al.2006）、槲皮素糖基轉(zhuǎn)移酶（Noguchi et al.2007）、紅景天苷糖基轉(zhuǎn)移酶（于寒松 2008）、人參皂苷 Rh2葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（何彥平 2010）、葛根素糖基轉(zhuǎn)移酶（劉吉升等 2011）等。本章基于 PCR 的 cDNA 基因克隆技術(shù)對(duì) 3 個(gè)蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了克隆測(cè)序、生物信息學(xué)分析并構(gòu)建 pET32a-UGT88F1 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)酶蛋白，為進(jìn)一步研究蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)及分離純化提供了理論依據(jù)。

2.1 材料與方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 植物材料
樣品為 20 d 葉齡葉片，采自西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場(chǎng)馬鋒旺教授種植的十年生黃元帥（Golden Delicious）蘋果樹，葉片用錫箔紙包裹，液氮速凍，-80℃保存。
2.1.1.2 菌種及質(zhì)粒
大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)，實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T 克隆載體，TakaRa 公司；pET-32a(+)表達(dá)載體，Novagen 生物公司。
2.1.1.3 試劑

PrimeScript  Reverse Transcriptase reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、Ex Taq酶、100bp 和 DL5000 DNAmarker、限制性內(nèi)切酶（HindⅢ、EcoRⅠ、KpnI、PstI、SalⅠ）均購(gòu)自 TaKaRa 公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒，，百泰克公司；SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒，上海生工公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷（X-gal）、氨芐青霉素（Amp）為 Sigma 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒 TIANprep Mini Plasmid Kit，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa PremixTaq 試劑盒，T4 ligase，BamHⅠ和 HindⅢ內(nèi)切酶購(gòu)于 TaKaRa；單克隆 Anti-His 抗體，天根生化科技（北京）有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠 lgG（H+L），碧云天生物技術(shù)公司；蛋白 Marker，預(yù)染型 Western Marker，EasyECLWestern Blot Ki（tDW101），TRANS公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），牛血清蛋白（BSA），Sigma 公司；其他試劑均為分析純。

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2.2 結(jié)果與分析
2.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆
提取蘋果組織總 RNA 經(jīng) 1.0% ( W /V ) 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖 2-2。28S 與18S 處亮度比約 2 ∶ 1，RNA 條帶基本無降解， A260/A280比值在 2.0-2.1，電泳條帶清晰整齊，無彌散現(xiàn)象，說明總 RNA 的完整性和純度都很好，可以用于下游的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。
將由蘋果葉片 RNA 擴(kuò)增的基因片段與克隆載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α , 藍(lán)白斑法篩選得到的陽性菌落，分別挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒 DNA，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳見圖 2-4，1500 bp 左右處的條帶為目標(biāo)條帶，3000 bp 左右處的條帶為質(zhì)粒條帶。結(jié)果表明蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶基因已克隆至 pMD18-T 載體上。
2.2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因生物信息學(xué)分析
將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 上 blast，與目標(biāo)基因均差 2 個(gè)堿基，匹配度 99%，說明成功克隆出 3 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因。從獲得的 3 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的信息得知，UGT71A15、UGT71K1 和 UGT88F1 基因 cDNA 長(zhǎng)度分別為 1416、1434 和 1452 bp，基因編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)目分別為 471、477 和 483 個(gè)。
2.2.2.1 同源性分析
將克隆的三個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列與一些其他的糖基轉(zhuǎn)移酶（查爾酮糖基轉(zhuǎn)移酶AmC4’GT、 LvC4’ GT、異黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶 GmIF7GT、花青素糖基轉(zhuǎn)移酶 RhGT1，見表2-14）氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，采用 MEGA4.1 軟件的 neighbor-jointing 法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖 2-5。結(jié)果表明，UGT88F1 和 UGT88F 家族的同源性較高，蘋果的 UGT71A15 和梨的 UGT71A16 同源性較高，蘋果的 UGT71K1 和 梨的 UGT71K2 同源性較高。

登陸 NCBI 網(wǎng)站，進(jìn)行氨基酸序列 Blastp 比對(duì)，結(jié)果如表 2-15，由表可知，UGT88F1與 UGT88F 家族的同源性較高，達(dá)到 79.9～99%，但是與 UGT88 家族其他亞家族的同源性并不高，只有 34.2～53%。UGT88F1 與紫蘇（Perilla frutescens）的 UGT88A7（AB362992）具有 51%的同源性，與綠毛山柳菊（Hieracium pilosella）的 UGT88A8（EU561017）具有 53%的同源性，與薔薇屬的雜交品種（Rosa hybrid cultivar）花青素5,3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶 RhGT1（AB201048）具有 43.9%的同源性，與金魚草（Antirrhinummajus）糖基轉(zhuǎn)移酶 AmC4'GT（AB198665）具有 41.2%的同源性。UGT71A15 除與UGT71A16 具有 92%同源性外，與其他糖基轉(zhuǎn)移酶具有 32.7～58%的同源性。UGT71K1除與 UGT71K2 具有 94%同源性外，與其他糖基轉(zhuǎn)移酶具有 33.2～46.6%的同源性。

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第三章 蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量分析................46
3.1 材料與方法....................................... 46
3.1.1 材料..................................... 46
四章 生長(zhǎng)期蘋果不同組織根皮苷含量和根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶酶活變化研究.......56
4.1 材料與方法................................................. 56
4.1.1 材料..................................... 56
4.1.2 方法..................................... 56
4.2 結(jié)果與分析................................................... 58
第五章 蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶分離純化及酶學(xué)特性....................66
5.1 材料與方法................................................... 66
5.1.1 材料 ..................................... 66

5.1.2 方法 ..................................... 66

第六章 蘋果葉多酚的抗氧化性及抗菌性研究

6.1 材料與方法
6.1.1 材料
6.1.1.1 蘋果原料
見第五章 5.1.1.1。
6.1.1.2 試劑
根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99.8%），美國(guó) Sigma 公司；原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素 B2、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸和茶多酚等標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）， 三吡啶三吖嗪（TPTZ），2,2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS），F(xiàn)olin-酚試劑，上海 Solarbio公司；色譜甲醇，美國(guó) TEDIA 公司；2,6- 二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等其他試劑為分析純。
6.1.1.3 受試菌

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、鼠傷寒沙門氏菌 LT2（Salmonella typhimurium LT2）、志賀氏菌（Shigella）和阪崎腸桿菌（Enterobacter Sakazakii）共 5 種，由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

6.1.1.4 儀器設(shè)備

Waters 高效液相色譜（含 1525 二元泵，2998 雙通道紫外檢測(cè)器，2707 自動(dòng)進(jìn)樣器，Breeze 色譜管理軟件等）， 美國(guó) Waters 公司；SHB- Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；R-200 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，瑞士 BüCHI 公司；cp2245 型分析天平，德國(guó) Sartorius 公司；Milli-Q 超純水儀，美國(guó) Millipore 公司；KH-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-2800 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器公司；LDZX-40KB 不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。
6.1.2 方法
6.1.2.1 樣品制備

參照 Drogoudi et al（.2008）的方法，準(zhǔn)確稱取 1.00 g 蘋果葉樣品于研缽中，加 10 mgVC 防止氧化，加入 30mL 甲醇，充分研磨，移到 100 mL 三角瓶中，超聲提取 30 min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 40 ℃下濃縮至干，用甲醇溶解殘留物定容至 10 mL，此為蘋果葉多酚樣品液，過 0.45 μm 濾膜，用 HPLC 分析蘋果籽多酚組成，樣品液稀釋 100 倍后用于總酚測(cè)定和抗氧化活性分析。取 0.2 g VC，用水定容至 100 mL，取 0.1 mL 用水定容至 10 mL，此 VC 溶液的濃度為 20 μg/mL。取 0.2 g BHT，用甲醇定容至 100 mL，取 0.1 mL 用甲醇定容至 10 mL，此 BHT 溶液的濃度為 20 μg/mL。20 μg/mLVC 和 20 μg/mL BHT 溶液用于抗氧化活性分析的對(duì)照。

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第七章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)和展望

7.1 結(jié)論
本文以具有代表性的早、中、晚熟蘋果為對(duì)象，對(duì)蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)、表達(dá)量分析；研究生長(zhǎng)期內(nèi) 7 個(gè)品種蘋果不同組織根皮苷含量變化與酶活的關(guān)系；研究根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶分離純化及酶學(xué)特性；研究蘋果多酚的抗氧化性及抗菌性等。主要結(jié)論如下：
7 個(gè)品種蘋果在生長(zhǎng)期內(nèi)芽、葉片、果皮、籽中根皮苷含量差異顯著，葉片中根皮苷的含量最高，依次為芽、籽，果皮中含量較低。生長(zhǎng)期內(nèi) 7 個(gè)品種蘋果葉片、果皮、籽根皮苷含量變化都呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。蘋果芽、葉片和果皮根皮苷含量與MdP2’GT 酶活呈正相關(guān)性。
建立根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶純化方法，純化倍數(shù)為71.0倍，比酶活達(dá)到632.0 U/mg，回收率達(dá)到 42.6%。SDS-PAGE 鑒定其表觀分子量為 50 kDa。酶的最適 pH 值為 8.5，最適溫度為 45 ℃，金屬離子在反應(yīng)體系的終濃度為 5 mM 時(shí)，Ca2+和 Mg2+對(duì)該蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶有促進(jìn)作用，Na+和 K+作用不明顯，Al3+、Cu2+、Mn2+和 Zn2+有顯著的抑制作用，Cu2+的抑制作用最強(qiáng)。以根皮素為底物測(cè)定 Km為 3.16μM，Vmax為0.77 nM/min·mg 蛋白。

7 個(gè)品種蘋果葉中，秦冠抗氧化能力最強(qiáng)，秦陽和紅蓋露較強(qiáng)，蜜脆、富士、紅星和黃元帥較弱。根皮苷清除自由基的能力介于 VC 和 BHT 之間。秦冠蘋果葉多酚和其含有的各種多酚對(duì)受試菌都顯現(xiàn)出抑菌活性，抑菌效果明顯優(yōu)于其含有的各種單酚，其抑菌性是茶多酚的 3~4 倍。根皮苷不含鄰位羥基對(duì)受試菌的抑菌效果弱于綠原酸、兒茶素等含有鄰位羥基的酚類。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：44465