第一章 文獻綜述

1.1 微生物多糖的研究概況
微生物多糖作為多糖的一個重要來源，包括細菌多糖、真菌多糖和藍藻多糖，與動植物多糖相比，其生產發(fā)酵不受季節(jié)、地域環(huán)境和病蟲害等自然因素的限制，培養(yǎng)條件可控，生產周期短，質量和產量穩(wěn)定，安全無毒，理化性質獨特。因此，具有較強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。微生物多糖的生物合成積累均發(fā)生在微生物生長期以后，根據其在細胞內不同的存在形式，通常被分為三種類型：（1）胞內多糖（Intracellularpolysaccharide），構成微生物細胞成分，為細胞提供碳源和能量；（2）細胞壁多糖（Cellwall polysaccharide），粘附在細胞表面，維持細胞結構的穩(wěn)定，包括肽聚糖和脂多糖；（3）胞外多糖（Exopolysaccharide），分泌到培養(yǎng)基中的菌表多糖，包括莢膜多糖和生物被膜多糖。
近年來，微生物多糖作為乳化劑、凝膠劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、保鮮劑、增稠劑、成膜劑、潤滑劑等，在食品、制藥、化工、石油及生物工程等多個領域得到廣泛應用（Ruas-Madiedo et al. 2002； Welman and Maddox 2003），另外，微生物多糖還具有免疫調節(jié)、降低膽固醇、抗腫瘤及抗炎癥等醫(yī)學或保健功能（Diniz et al. 2003； Rizk et al. 2009；Vinderola et al. 2005）。微生物多糖的重要生物學效應也日益被人們所重視，因此它也成為當今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關注的焦點，也是當今研究的熱點領域之一。
1.1.1 生物學活性
1.1.1.1 抗氧化活性

在正常的新陳代謝過程中機體產生的自由基為具有一個或者幾個不配對電子的原子或原子團，具有一定的穩(wěn)定性和高度氧化性，參與細胞增殖、壞死、凋亡、分化等多種生理現象（Finley et al. 2011）。在正常狀態(tài)下，氧化過程為機體提供能量，機體的氧化與抗氧化處于一種動態(tài)平衡中（Abdhul et al. 2014）。但是，過量的自由基如羥基自由基（ OH）、超氧陰離子自由基（ O2-）、過氧化氫（H2O2）、活性氧（ROS）會破壞機體內自由基穩(wěn)定平衡的動態(tài)，導致氧化應激反應的產生（Guo et al. 2012），引發(fā)機體病變如癌癥、肺損傷、糖尿病及動脈硬化、炎癥等（Sayre et al. 2008）。外源性抗氧化劑可以通過阻斷自由基鏈的氧化和提供氫離子來阻止自由基鏈的氧化（Xu et al.2011）。隨著人們對微生物多糖及其復合物的抗氧化活性作用的深入研究，越來越多的具有抗氧化活性的微生物多糖被發(fā)現。Asker 等（2009）發(fā)現 Microbacterium terregens產胞外多糖具有顯著清除自由基的活性，其中組分 CPSI 清除 DPPH 自由基的 IC50僅為230 μg/mL。Xu 等（2011）報道從 Bifidobacterium animalis RH 發(fā)酵液中提取的胞外多糖具有清除羥基自由基、DPPH 自由基和超氧陰離子的體外抗氧化活性，同時，體內抗氧化的試驗表明，D-半乳糖誘導的衰老鼠在口飼 30 天后，其血清中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）和總抗氧化能力與肝臟中的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性都有顯著的提高。Bacterium Bordetella sp.產胞外多糖清除 ABTS、H2O2、 OH 自由基和脂質過氧化的能力分別是維生素 C 的 2、86、134 和 18 倍，而且對 AAPH 誘導的 DNA 損傷具有顯著的保護作用（Xu et al. 2011）。Zhang 等（2012）報道 Lactobacillusplantarum 產胞外多糖可以降低自由基和 H2O2誘發(fā)的小鼠肝組織中丙二醛（MDA）的生成。

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1.2 西藏靈菇的研究進展
西藏靈菇（Tibetan Kefir），類似于 kefir 粒，是 kefir 的一個品系，源自西藏高原的特有珍稀菌種，是我國獨有的世界珍寶。西藏靈菇是由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等微生物在多糖的環(huán)境中，經過長期的相互適應與協同作用形成的非常復雜的菌相共生體系，即菌粒（Marshall and Cole 1985）。西藏靈菇菌粒呈乳白色或淡黃色，狀如蒸熟的米粒，有彈性，在牛奶中長期培養(yǎng)，個體會增大變多，形狀如盛開的雪蓮，故又被稱為“西藏雪蓮”。西藏靈菇發(fā)酵乳與傳統的酸奶相比，最顯著的特征是除了乳酸發(fā)酵以外，還伴有輕微的由酵母引發(fā)的酒精發(fā)酵，因此，它不僅具有發(fā)酵酸奶特有的酸味和香味，還有輕微的醇香味（周劍忠等 2006）。但是，由于西藏靈菇的微生物組成比較復雜，采用傳統的發(fā)酵劑傳代方法進行擴大生產，極易造成菌相失衡，導致發(fā)酵乳的風味和品質的變化，失去原有的優(yōu)良特征，從而，限制了其工業(yè)化生產。目前這種產品主要通過西藏靈菇菌粒的傳遞在民間流傳。
1.2.1 西藏靈菇的微生物組成

西藏靈菇的菌相十分復雜，不同地區(qū)不同培養(yǎng)條件下的西藏靈菇菌種差別很大。表1-1 列出了目前文獻報道的分離自不同批次的西藏靈菇中的乳酸菌、醋酸菌和酵母菌。從表中可以看出，從西藏靈菇中分離到的乳酸菌和酵母菌較多，醋酸菌較少。酵母菌多屬于假絲酵母屬和克魯維酵母屬，均屬好氧菌，條件適宜時，在 20-30 ℃下僅需幾個小時就能繁殖一代；乳酸菌多為乳桿菌、乳球菌和明串珠菌，這些菌均為兼性厭氧或微好氧。醋酸菌的種類較少，目前報道的只有醋桿菌、沖繩醋酸菌、東方醋酸菌。

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第二章 西藏靈菇多糖的基本特性與抗氧化活性

氧化是機體內一個重要的生化過程，在正常狀態(tài)下，自由基和氧化過程為機體提供能量，機體的氧化與抗氧化處于動態(tài)平衡中（Abdhul et al. 2014）。但是，過量的自由基如羥基自由基（ OH）、超氧陰離子（ O2-）、過氧化氫（H2O2）及活性氧（ROS）會破壞機體內自由基穩(wěn)定平衡的動態(tài)，導致氧化應激反應的產生（Guo et al. 2012），損壞細胞中的蛋白質、脂質和 DNA（Salvemini et al. 1999），引發(fā)機體病變如各種癌癥、肺損傷、糖尿病及動脈硬化、炎癥等（Sayre et al. 2008）。外源性抗氧化劑可以通過阻斷自由基鏈的氧化和提供氫離子來阻止自由基鏈的氧化（Xu et al. 2011）。但是，人工合成的抗氧化劑如叔丁基對苯二酚（TBHQ）、二丁基羥基甲苯（BHT）、沒食子酸丙酯（PG）與丁基羥基茴香醚（BHA）等會造成肝損傷并會引發(fā)癌癥（Grice 1988），因此，對廣譜、安全、高效的天然抗氧化劑的研究開發(fā)已經成為當今食品、日化和藥品等領域的熱點。

西藏靈菇（Tibetan kefir）是 kefir 粒的一種，來源于中國西藏，是由酵母、乳酸菌和醋酸菌多種微生物形成的一個共生菌相，在其生長繁殖過程中會分泌胞外多糖（Exopolysaccharide）（孟利和張?zhí)m威 2006；Zhou et al. 2009）。據報道，西藏靈菇發(fā)酵乳具有抑菌、抗炎癥、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用（Diniz et al. 2003；Liu 2002；Rodrigues etal. 2005；楊希娟等 2007），這些生物活性很可能與發(fā)酵乳中的多糖有關（Maeda et al.2004；Piermaria et al. 2011；Rodrigues et al. 2005）。因此，本章在對西藏靈菇發(fā)酵乳中的多糖進行提取和分離純化的基礎上，研究其對 DPPH 和 ABTS 自由基的清除能力、對鐵的還原能力及對 AAPH 和 Cu2+/H2O2誘導的蛋白損傷的保護作用，以評價其體外抗氧化活性。同時，對其基本的理化性質，包括單糖組成、微觀結構和熱學特性進行了分析，為西藏靈菇多糖的開發(fā)利用提供理論參考。

2.1 材料與儀器設備
2.1.1 菌種

新鮮牛乳，采購于西北農林科技大學畜牧養(yǎng)殖場；2，2’-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽（2, 2’-Azinobis （3-ethylbenzenothiazoline-6-sulphonic acid，ABTS）、水溶性維生素 E（6-hydroxy-2, 5, 7, 8-teramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、1，1-二苯-2-苦基肼（2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，，DPPH）、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪(1, 3, 5-tri（2-pyridyl）-2, 4 , 6-triazine，TPTZ）、2，2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2, 2’-azobis（2-aminopropane）dihyrochloride，AAPH）（Sigma，生化試劑）；考馬斯亮藍 R-250、牛血清白蛋白（BSA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯聚酰胺、甘氨酸、巰基乙醇、溴酚藍、過硫酸銨、三磷酸腺苷[ATP]、二磷酸腺苷[ADP]（Amresco，生化試劑）；苯酚、濃硫酸（西隴化工股份有限公司，分析純）；硼氫化鈉（NaBH4）、吡啶、乙酸酐（科龍化工試劑廠，分析純）；冰乙酸、甲醇（天津市博迪化工有限公司，分析純）；三氯乙酸（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；三氟乙酸（Aladdin，生化試劑）；其他試劑均為市售分析純。

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2.2 試驗內容與方法
2.2.1 西藏靈菇的復活
取存放于-40 ℃下的西藏靈菇菌粒，用無菌冷水反復沖洗 3 遍，再按 5 %的接種量接種至脫脂乳培養(yǎng)基中（Guzel-Seydim et al. 2000），25 ℃下靜置培養(yǎng) 24 h（Garrote etal. 1998），然后用無菌金屬網過濾，并用無菌冷水沖洗 3 遍，得到的西藏靈菇菌粒再轉接至脫脂乳培養(yǎng)基中，如此重復培養(yǎng)復活，連續(xù) 3-5 次，即得復活后的菌粒。
2.2.2 西藏靈菇發(fā)酵過程中多糖含量的變化
取西藏靈菇菌粒，按 5 %的接種量接入脫脂乳培養(yǎng)基中，25 ℃下靜置培養(yǎng) 24 h，每隔 4 h 取樣，測定發(fā)酵乳中多糖含量的變化。每個處理做三個平行。
發(fā)酵結束后，將發(fā)酵乳加熱至 100 ℃并維持 10 min，冷卻至室溫后 8000 rpm 離心15 min，收集上清，在蒸餾水中透析 24 h，采用苯酚-硫酸法測定上清中總糖的含量（Dubois et al. 1956），以葡萄糖為標準物，按表 2-1 所示試劑配方，將混合液搖勻，靜止冷卻后于 490 nm 處測定吸光值，繪制標準曲線。
2.2.3 西藏靈菇多糖的制備
西藏靈菇多糖的制備參照 Wang 等（2010）的方法，稍作修改。西藏靈菇菌粒按 5 %的接種量，接入脫脂乳培養(yǎng)基中，25 ℃下靜置培養(yǎng)后，無菌條件下濾去菌粒，剩余的發(fā)酵乳在 100 ℃下加熱 10 min，以溶解粘附在細胞表面的多糖（Wang et al. 2008），8000 rpm 離心 15 min 后去沉淀，上清液濃縮后加入三倍體積的 95 %的乙醇于 4 ℃下醇沉過夜，8000 rpm 離心 15 min 得到沉淀。沉淀溶于蒸餾水后，加入 1/5 體積的 10 %的三氯乙酸溶液，振蕩 30 min 后，10000 rpm 離心 15 min 去沉淀，除去蛋白。調整上清pH至7.0后，加入三倍體積的95 %的乙醇于4 ℃下醇沉過夜，8000 rpm離心15 min，去上清，沉淀溶于蒸餾水，透析后冷凍干燥，即得西藏靈菇多糖。

等摩爾稱取鼠李糖（Rha）、巖藻糖（Fuc）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcA）及半乳糖醛酸（GalA），加入 90 mg 硼氫化鈉與 6 mL 蒸餾水，震蕩后，室溫下還原 1.5 h；滴加 25 %（v/v）的冰乙酸至無氣泡產生，以分解過量的硼氫化鈉，60 ℃下減壓蒸發(fā)至干，加入 4 mL 甲醇（含 1 %鹽酸），減壓蒸干，重復 5 次除去硼酸根。殘渣溶于 6 mL 甲醇（含 1 %鹽酸）中，72 ℃下烘干。向殘渣中加入 0.7 mL 吡啶和 0.7 mL 乙酸酐，密封后于沸水浴中反應 1 h，所得樣液過 0.25 μm 有機濾膜后進行 GC 分析。

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第三章 西藏靈菇多糖的流變學特性與乳化性質.......................27
3.1 材料與儀器設備............................................ 27
3.1.1 試驗樣品................................................. 27
3.1.2 主要試劑................................................ 27
第四章 西藏靈菇多糖的組分分析與結構解析........................39
4.1 材料與儀器設備............................................. 39
4.1.1 試驗樣品................................................... 39
4.1.2 主要試劑.................................................. 39
第五章 西藏靈菇中的多糖產生菌及其多糖的基本特性與活性 ...........53
5.1 材料與儀器設備.............................................. 53
5.1.1 菌種....................................................... 53

5.1.2 培養(yǎng)基...................................................... 53

第六章 西藏靈菇菌粒形成的微生物基礎

西藏靈菇（Tibetan kefir）是 Kefir 的一種，與 kefir 的菌相構成與粒的特征相似。Kefir 現代的生產是基于連續(xù)的牛奶發(fā)酵，菌粒微生物的生長繁殖和菌粒生物質的產生使生物量每天增加 5 %-7 %（Libudzisz and Piatkiewicz 1990），其中包括蛋白和多糖的分泌合成。Wang 等（2012）認為與菌粒形成相關的微生物群可以看做是一個菌膜（Biofilm），控制菌膜形成的過程包括大分子物質粘附表面的形成、細胞的粘附、細胞間的相互作用與復合菌系的生長繁殖（Sim es et al. 2010）。微生物菌群的表面粘附和菌膜的形成是一個非常復雜的過程，與細胞的表面特性，特別是細胞的自聚集（Auto-aggregation）特性緊密相關（Sim es et al. 2010）。

迄今為止，Kefir 和西藏靈菇只能在原有的菌粒基礎上進行生長繁殖（Schoevers andBritz 2003），有很多研究試圖用 kefir 粒中常見的菌種進行單菌或者復合菌培養(yǎng)來形成kefir 粒，但是由于對菌粒形成機制尚不了解，最后都沒有成功（Libudzisz and Piatkiewicz1990；Liu and Moon 1983）。本章對從西藏靈菇菌粒中分離得到的 10 株乳酸菌、醋酸菌和酵母菌的細胞表面性質和菌膜形成能力進行了分析，以了解它們在西藏靈菇菌粒形成過程中起到的作用；研究酵母菌與乳酸菌和醋酸菌之間的相互作用，明確菌粒形成的可能機制；對從西藏靈菇中分離得到的 15 株菌進行復配，研究混合培養(yǎng)轉接過程中“菌�！钡男纬汕闆r，對混合培養(yǎng)的發(fā)酵乳和西藏靈菇發(fā)酵乳中的揮發(fā)性物質進行對比和分析。

6.1 材料與儀器設備
6.1.1 菌種
第二章 2.2.1 中復活好的西藏靈菇樣品。
第五章分離純化得到的純培養(yǎng)物，分別為：
RJ-5、RJ-1、RJ-2，假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）；JM-4、JM-6，乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. Lactis）；RJ-4、CJ-2、CJ-3、CJ-4，沖繩醋酸菌（Acetobacter okinawensis）；JM-1，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；JM-2、JM-3、JM-5、JM-7、JM-8，單胞釀酒酵母（Kazachstania unispora）。
6.1.2 培養(yǎng)基

（1）脫脂乳培養(yǎng)基：新鮮牛乳在 4000 rpm 下離心 10 min，每 100 mL 分裝于 250 mL的錐形瓶中，105 ℃下滅菌 20 min。

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第七章 結論、創(chuàng)新點與展望

7.1 結論
西藏靈菇菌粒是由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等多種微生物在發(fā)酵的過程中，經過長期相互適應與協同作用的過程中形成的一種多菌種共生體，推測多糖是促進這種共生體形成的主要組成成分，也是賦予西藏靈菇發(fā)酵乳以提高免疫力、抗癌、防癌、降血糖等功效的主要成分。然而，目前有關西藏靈菇菌粒的微生物菌群、菌粒形成的內在機制以及西藏靈菇發(fā)酵乳多糖的活性與理化性質等方面的研究還少有報道。此外，西藏靈菇菌粒中的微生物菌群會隨著發(fā)酵環(huán)境的改變而變化，從而導致發(fā)酵過程不穩(wěn)定，產品質量難以保證。為此，本文在對西藏靈菇發(fā)酵乳多糖進行分離純化的基礎上，研究其單糖組成、表觀微觀結構、抗氧化活性、流變學特性、乳化性質、組分構成、主要組分及結構特征；對西藏靈菇菌粒和發(fā)酵乳中的微生物進行分離純化、菌群分析，對單菌株在發(fā)酵乳中所產多糖的特性，以及多菌種復配后菌粒的形成情況進行了研究，獲得以下主要結論：
（1）西藏靈菇多糖的基本特性與抗氧化活性。對西藏靈菇多糖進行分離純化及理化性質分析后得出，該多糖為中性多糖，由葡萄糖和半乳糖組成，兩者的摩爾比為1:1.88；多糖的表面呈粗糙的顆粒狀，結構致密；熔點為 131.46 ℃，熱焓值為 209.6 J/g，熱穩(wěn)定性好；能夠有效地清除 DPPH 和 ABTS 自由基，還原 Fe3+離子，對 AAPH 和Cu2+/H2O2誘導的蛋白損傷具有較強的保護作用。
論文對西藏靈菇發(fā)酵乳多糖的理化特性、流變學特性、組分構成等方面進行了較為全面的研究，研究結果可為該多糖的綜合利用提供重要的理論依據；此外，論文還從西藏靈菇菌粒及發(fā)酵乳中的微生物菌種組成，每種微生物的多糖產生特性，以及菌粒分離菌的成膜性、聚集性等方面進行了分析研究，探討了西藏靈菇菌粒形成的微生物基礎；而且通過菌種復配成功地得到了初步成形的多菌種共生體。這些結果可為西藏靈菇菌粒的人工控制與質量保證提供重要的理論基礎。然而，受制于現有試驗技術和論文執(zhí)行期的時間限制，有關西藏靈菇發(fā)酵乳多糖和菌粒形成機制方面還需要在以下幾個方面進行進一步研究與補充完善：

（1）西藏靈菇發(fā)酵乳多糖的核磁分析結果沒有拿到。作者經過多次努力，企圖通過核磁分析的方法獲得該多糖中有關糖苷鍵等更為詳細的結構信息，但是，即使該多糖經過多次分離純化，由于其黏性很大，溶解性差，在核磁共振測定中的信號很差，沒有得到更充分的核磁數據來進一步佐證多糖的結構。在后續(xù)研究中，或許可以通過高溫核磁共振儀等其它檢測手段解決這一問題。

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參考文獻（略）

本文編號：41362