第一章 文獻(xiàn)綜述

1.1 百子蓮屬植物種質(zhì)資源研究概況
百子蓮（Agapanthus praecox）又名“藍(lán)百合”、“非洲百合”，原產(chǎn)自非洲南部，為單子葉常綠或多年生草本花卉。百子蓮屬植物具有很強(qiáng)的觀賞性，葉片基生，披針形，深綠色帶有光澤，長(zhǎng)度可達(dá) 60 cm 左右。花序?yàn)榫蹅慊ㄐ�，每個(gè)花序上著生小花 50~130 朵，花漏斗形，花莖直立，可以生長(zhǎng)至 1 m 長(zhǎng)，花期在夏秋兩季長(zhǎng)達(dá) 30~40 天，百子蓮栽培種的花期在上海集中在 6~8 月[1]。百子蓮科只有百子蓮屬一個(gè)屬，其中常綠種 2 個(gè)百子蓮（A africanus）和旱花百子蓮（A praecox），落葉種 4 個(gè)鈴花百子蓮（A campanulatus）、具莖百子蓮（A caulescens）、寇蒂百子蓮（A coddii）和德拉肯斯堡百子蓮（A inapertus）。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，百子蓮在國(guó)際花卉業(yè)發(fā)展中脫穎而出，成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家的高檔主流花卉，風(fēng)靡全球的觀賞花卉，從道路綠化、庭院栽培到切花生產(chǎn)，都體現(xiàn)出了百子蓮屬植物較高的觀賞價(jià)值[2]。百子蓮在國(guó)外是較為流行的花卉品種，有關(guān)百子蓮的研究較多而且應(yīng)用較廣泛，研究多集中在分類學(xué)、藥效及成份分析、分子育種及園林應(yīng)用等方面，應(yīng)點(diǎn)出幾個(gè)代表性成果。百子蓮屬植物自 2000 年引種到國(guó)內(nèi)以來(lái)，對(duì)其的研究主要集中在栽培和生理方面。對(duì)百子蓮的生理生態(tài)習(xí)性、開花生物學(xué)特性、種子生物學(xué)和幼苗生長(zhǎng)特性、快速繁殖體系、組培再生體系及其在園林中的應(yīng)用等方面均有研究。
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1.2 植物超低溫保存相關(guān)研究進(jìn)展
植物超低溫保存(Crypreservation)是指在低于-80°C 的溫度條件下（通常為液氮溫-196°C ），對(duì)植物器官、組織或者細(xì)胞進(jìn)行保存[18]。在低溫條件下，植物材料細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎停止，保存的植物材料處于相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)。超低溫降保存可降低甚至完全抑制植物材料的生活力及基因變異的可能性，保持植物材料遺傳性狀的穩(wěn)定和形態(tài)發(fā)生的潛能[19]。植物超低溫保存技術(shù)應(yīng)用的理論可分為兩類，一類依據(jù)冷凍脫水原理，該理論是超低溫保存發(fā)展起來(lái)的基本即植物細(xì)胞在有冰凍保護(hù)劑存在的降溫過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞外的介質(zhì)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)尚未結(jié)冰，產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)外的蒸汽壓差，只要降溫速率不超過(guò)脫水的連續(xù)性，細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)不斷向細(xì)胞外擴(kuò)散，細(xì)胞原生質(zhì)濃縮，從而降低細(xì)胞內(nèi)含物的冰點(diǎn)，能有效地避免細(xì)胞質(zhì)或液泡中冰晶的形成，這種逐漸脫去細(xì)胞內(nèi)水分的過(guò)程稱為“保護(hù)性脫水”；另一類依據(jù)溶液玻璃化原理，細(xì)胞內(nèi)晶核形成、晶核生長(zhǎng)是細(xì)胞結(jié)冰必經(jīng)的兩個(gè)過(guò)程，若溶液降溫速度足夠快，溶液內(nèi)很少或者幾乎沒有形成均一的晶核，或溶液內(nèi)的晶核生長(zhǎng)缺乏足夠的時(shí)間，溶液就會(huì)進(jìn)人玻璃態(tài)，玻璃態(tài)是一種透明的固態(tài)，此時(shí)的溫度稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。植物材料經(jīng)高濃度的滲透性化合物處理后，迅速投入液氮中較易進(jìn)入玻璃態(tài)，玻璃態(tài)在液氮保存中是穩(wěn)定的，對(duì)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)影響很小，保證了植物材料復(fù)蘇后的細(xì)胞活力[20]。
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第二章 超低溫保存過(guò)程中百子蓮胚性愈傷組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

2.1 材料與方法
本試驗(yàn)所用百子蓮胚性愈傷組織（embryogenic callus，EC）由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院園林植物種質(zhì)工程試驗(yàn)室提供。百子蓮 EC 在含 10 mg/L 毒莠定（PIC）、30 g/L 蔗糖和 10 g/L 瓊脂粉的 MS 培養(yǎng)基上每隔 30 d 繼代一次，取繼代培養(yǎng) 20 d 后的 EC 作為對(duì)照和后續(xù)試驗(yàn)的材料。對(duì)百子蓮 EC 超低溫保存過(guò)程中預(yù)培養(yǎng)、脫水處理、恢復(fù)培養(yǎng)及對(duì)照處理的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和比較。超低溫保存各關(guān)鍵步驟如下，預(yù)培養(yǎng)：將繼代培養(yǎng) 20 d 的百子蓮 EC（對(duì)照樣品 CK）放在 05 mol/L 蔗糖的 MS 固體培養(yǎng)基上低溫（4°C ）預(yù)培養(yǎng) 2 d。裝載：將預(yù)培養(yǎng)后的 EC 置于裝載液（2 mol/L 丙三醇+04 mol/L 蔗糖+ 10 mmol/LKNO3+MS 液體培養(yǎng)基）中在室溫下處理 60 min。脫水：將裝載處理后的百子蓮的 EC移入 PVS2 玻璃化溶液（30%丙三醇+15% DMSO+15%乙二醇+04 mol/L 蔗糖+MS液體培養(yǎng)基）中在 0°C 下脫水處理 40 min，脫水后立即將裝有 EC 的 PVS2 冷凍管浸入液氮中凍存。洗滌：液氮凍存 1 h 后，將凍存管置于 40°C 水浴中快速解凍 90 s，再轉(zhuǎn)到室溫下用去裝載液（12 mol/L 蔗糖+ 10 mmol/L KNO3 +MS 液體培養(yǎng)基）洗滌 3 次，每次間隔 10 min�；謴�(fù)培養(yǎng)：超低溫保存后的百子蓮 EC 置于新的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24 h。
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2.2 結(jié)果與分析
電鏡觀察結(jié)果見圖 2-1 所示：百子蓮 EC 細(xì)胞顯示出清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞含有多個(gè)大小不一的液泡，一個(gè)大液泡占據(jù)了細(xì)胞的大部分空間，小體積液泡較少（圖 2-1 a1）。細(xì)胞的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞膜緊貼細(xì)胞壁。細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器完好，線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)出正常的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，其中線粒體的數(shù)量最多，線粒體的膜結(jié)構(gòu)和內(nèi)脊清晰可見（圖 2-1 a2-a4）。細(xì)胞中可見包含淀粉粒的淀粉體和脂質(zhì)體（圖 2-1 a3-a4）。以上觀察說(shuō)明這是一個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、代謝正常的百子蓮 EC 細(xì)胞。高滲培養(yǎng)基對(duì)百子蓮 EC 進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞脫出部分自由水，提高細(xì)胞的抗凍能力。在 05 mol/L 蔗糖的 MS 固體培養(yǎng)基上，4°C 條件下預(yù)培養(yǎng) 2 d后，百子蓮 EC 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一些變化，觀察結(jié)果見圖 2-2 所示：細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)壁分離，但細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，大部分細(xì)胞質(zhì)壁分離程度輕微，小部分質(zhì)壁分離嚴(yán)重的細(xì)胞，在細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)之間產(chǎn)生了較大明顯的空腔（圖 2-2 b1-b2）。細(xì)胞內(nèi)大液泡變小，小液泡增多。與對(duì)照相比較細(xì)胞中細(xì)胞器不同程度的皺縮，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化明顯，線粒體為數(shù)量最多的細(xì)胞器，與對(duì)照處理相比，線粒體數(shù)量增多，多數(shù)線粒體緊貼細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)排列分布（圖 2-2 b2）。線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)生了不同程度的皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)大淀粉粒變小，小淀粉粒增多（圖 2-2 b3-b4）。

第三章 超低溫保存過(guò)程中百子蓮EC脂肪酸的組成和變化.........23
3.1  材料與方法........23
3.2 結(jié)果與分析........24
3.2.1 百子蓮 EC 飽和脂肪酸的組成及變化........24
3.2.2 百子蓮 EC 不飽和脂肪酸的組成及變化........25
3.3 討論........27
第四章 百子蓮 EC超低溫保存過(guò)程中鈣離子的分布變化........29
4.2  結(jié)果與分析........30
4.2.1 百子蓮 EC 繼代培養(yǎng)（對(duì)照）細(xì)胞 Ca2+亞細(xì)胞定位觀察........30
4.2.2 超低溫保存過(guò)程中細(xì)胞Ca2+亞細(xì) 胞定位觀察........31
4.2.3 焦銻酸鈣沉淀顆粒組分的能譜分析........35
4.2.4 百子蓮 EC 超低溫保存過(guò)程中Ca2+熒光 變化測(cè)定........36
4.2.5 超低溫保存過(guò)程中百子蓮EC細(xì)胞內(nèi) Ca2+熒光強(qiáng)度變化........38
4.3 討論........ 38
第五章 百子蓮 EC 超低溫保存過(guò)程中比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析........41
5.1  材料與方法........ 41
5.2  結(jié)果與分析........47

第五章 百子蓮 EC 超低溫保存過(guò)程中比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

百子蓮為非模式植物，其基因組序列與轉(zhuǎn)錄組序列未知。目前只能依靠傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法（cDNA-AFLP，SSH，DDRT-PCR 等）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析以篩選出某個(gè)生物過(guò)程中的差異表達(dá)基因，但是傳統(tǒng)的方法由于技術(shù)瓶頸導(dǎo)致其分辨率較低，大部分差異基因丟失，這對(duì)深入科學(xué)研究帶來(lái)了較大的限制。目前二代高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）的興起，極大地推動(dòng)了非模式植物的基因組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠快速而全面揭示某個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組序列信息，這對(duì)今后非模式物種的基因克隆、功能與結(jié)構(gòu)分析、遺傳轉(zhuǎn)化及基因差異表達(dá)（RNA-seq）等方面的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在超低溫保存過(guò)程中對(duì)百子蓮 EC 的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、膜脂組成、和鈣離子分布的研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)脫水處理是超低溫保存中的最關(guān)鍵處理步驟，本研究結(jié)合RNA-seq 測(cè)序?qū)Π僮由?EC 對(duì)照處理、脫水處理及恢復(fù)培養(yǎng)進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度綜合闡述百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存的逆境應(yīng)答的機(jī)制，從而為進(jìn)一步優(yōu)化超低溫保存技術(shù)體系的相關(guān)參數(shù)提供理論依據(jù)。

結(jié)論

本項(xiàng)試驗(yàn)開展了百子蓮 EC 玻璃化超低溫保存各關(guān)鍵步驟中的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞膜脂組成分析、細(xì)胞 Ca2+分布及比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，初步得到以下幾個(gè)結(jié)論：
1.百子蓮 EC 細(xì)胞能通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化響應(yīng)超低溫保存過(guò)程中的逆境脅迫，璃化溶液脫水處理中主要經(jīng)受氧化脅迫。細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的損傷及細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致超低溫保存細(xì)胞死亡�？赡娴募�(xì)胞結(jié)構(gòu)變化是細(xì)胞對(duì)逆境脅迫自我保護(hù)的一種適應(yīng)性響應(yīng)，提高自身的抗性，不可逆的結(jié)構(gòu)變化將造成細(xì)胞的死亡。
2.百子蓮 EC 經(jīng)預(yù)培養(yǎng)和脫水處理后，不飽和脂肪酸含量升高可以維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性，減少逆境脅迫損傷，提高細(xì)胞對(duì)低溫脅迫和氧化脅迫的抗性。
3.Ca2+是逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重要的信號(hào)分子。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)不均勻梯度分布和細(xì)胞質(zhì)中的 Ca2+濃度變化響應(yīng)逆境脅迫信號(hào)，從而調(diào)控生理代謝及基因表達(dá)。證實(shí)脫水處理中百子蓮 EC 在逆境中主要經(jīng)受氧化脅迫和低溫脅迫，可在脫水處理中的玻璃化溶液中添加還原性物質(zhì)優(yōu)化百子蓮超低溫保存體系。
4.基于 RPKM 法比較分析了組織間差異表達(dá)基因，對(duì)照處理的胚性愈傷組織與脫水處理的胚性愈傷組織間差異表達(dá)基因總數(shù)為 3027。脫水處理的胚性愈傷組織與恢復(fù)培養(yǎng)的胚性愈傷組織間差異表達(dá)基因總數(shù)為 5737。GO 顯著性富集分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因主要富集在：外源刺激響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、內(nèi)吞作用、糖代謝、次生代謝、質(zhì)膜結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄因子。在脫水處理中百子蓮 EC 對(duì)逆境的響應(yīng)表現(xiàn)在細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)、還原性物質(zhì)和植物激素的變化，在恢復(fù)培養(yǎng)中對(duì)超低溫保存處理逆境響應(yīng)表現(xiàn)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)修復(fù)及發(fā)育相關(guān)物質(zhì)合成代謝。在優(yōu)化百子蓮超低溫保存體系中適當(dāng)添加植物激素和還原性物質(zhì)，可能對(duì)提高百子蓮超低溫保存的恢復(fù)生長(zhǎng)率有積極作用。
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參考文獻(xiàn)（略）