許多許多馬鈴薯育種工作將重點(diǎn)放在了較少的生產(chǎn)資料(像水、肥料、土地)來獲得比目前主栽品種產(chǎn)量和品質(zhì)更高的優(yōu)良品種的培育上,同時將注意力集中于簽定品種對主要病害和蟲害的育種工作將重點(diǎn)放在了較少的生產(chǎn)資料(像水、肥料、土地)來獲得比目前主栽品種產(chǎn)量和品質(zhì)更高的優(yōu)良品種的培育上,同時將注意力集中于簽定品種對主要病害和蟲害的抗性上減少農(nóng)藥的需求,借此保持或提高環(huán)境的安全性。長期的馬鈴薯常規(guī)育種顯示,由于馬鈴薯栽培種的4體遺傳特性,不僅使有效基因的積累十分困難,同時目標(biāo)性狀的選擇準(zhǔn)確性和效率均很低,加之長期的種內(nèi)雜交育種而造成的遺傳資源狹窄,人們愈來愈認(rèn)識到常規(guī)育種速度已很難在短期滿足市場對馬鈴薯品種的需求。世界范圍內(nèi)的馬鈴薯育種正經(jīng)歷一個快速變化的時期。近年生物技術(shù)的進(jìn)展使得培育帶有復(fù)合修飾性狀的越來越多復(fù)雜轉(zhuǎn)基因作物成為可能。馬鈴薯基因工程正在全球范圍內(nèi)開展,通過創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株來研究目的基因的表達(dá)產(chǎn)質(zhì)量性狀的影響。植物已經(jīng)進(jìn)化出一個復(fù)雜的病原體防御體系,它由特定防御途徑的誘導(dǎo)和細(xì)胞潤亡之間牢固的平衡所驅(qū)動。近年,針對涉及這些防御的許多基因及其產(chǎn)物的鑒定與了解上取得了長足進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)推動植物先天防御體系操作、抗真菌蛋白的產(chǎn)生和對真菌致病因子的中和為基礎(chǔ)來產(chǎn)生真菌抗性轉(zhuǎn)基因植物的種種策略的發(fā)展。

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2PCAMBIA2301質(zhì)粒的RIPs基因擴(kuò)增及RIPs基因基因測序

2.1材料與方法

取-80冰箱內(nèi)保存的農(nóng)桿菌菌種,在固體板上劃線,每個凍干管內(nèi)的培養(yǎng)物接種1個固體平板。靜置培養(yǎng)至單菌落生長至粟粒大小進(jìn)行下一步操作。在Millam等的轉(zhuǎn)化方案中有兩點(diǎn)值得在今后的研究中借鑒:(1)在不同器官作為轉(zhuǎn)化外植體的選擇上,節(jié)間通常反應(yīng)最為靈敏且對高生產(chǎn)率體系而言是最快的體系。(2)抗生素篩選推遲到到第二種再生培養(yǎng)基(相當(dāng)于本研究的MSGII)上再進(jìn)行(他們的方案中在共培養(yǎng)結(jié)束后12d才有了抗生素篩選,本研究中只有2d)。因?yàn)樗麄兘?jīng)過廣泛的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后過早進(jìn)行選擇幾乎沒什么益處,實(shí)際上再生率會因此而降低。

2.2結(jié)果與分析

由表3可見,再生體系對照(CK-Kan)外植體全部愈傷化(見圖3)并產(chǎn)生20%(4/20)再生芽(部分產(chǎn)生再生芽的愈傷組織見圖4),證明該再生體系具有誘導(dǎo)創(chuàng)傷葉圓片愈傷化和誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生再生芽的能力(參看附錄圖a),再生體系有效;另一個對照"CK+Kan"上無愈傷組織形成,該處理在轉(zhuǎn)接到含Kan的MSGII上繼代則會觀察到外植體失綠白化(圖5左側(cè)H角瓶),與無選擇則壓力的"CK-Kan"比較,證明50mg/L卡那霉素作為選擇壓力有效;轉(zhuǎn)化處理在MSGI上愈傷化比例與對照CK-Kan相同,為100%(80/80)(見圖6),轉(zhuǎn)化抗性芽再生比例為6.25%(5/80)(部分產(chǎn)生抗性芽的愈傷組織見圖7),比CK-Kan芽再生比例20%低許多。本試驗(yàn)進(jìn)行了2批次轉(zhuǎn)化,每批轉(zhuǎn)化了40個外植體,外植體均100%愈傷化。其中第1批有3個愈傷組織上誘導(dǎo)出了抗性再生芽,從這3個愈傷組織上陸續(xù)獲得39個抗性芽,在抗性芽進(jìn)行離體繁殖時農(nóng)桿菌污染5株棄去,成活34株,其中有記錄的1個愈傷組織上生了8個抗性芽;第2批有2個愈傷組織上誘導(dǎo)出了抗性再生芽,參考前人的做法,本批只從每個愈傷組織上各取最早形成的1個抗性再生芽。2批次轉(zhuǎn)化總計(jì)80個外植體,全部愈傷化,其中5個愈傷組織上誘導(dǎo)出了41個抗性再生芽,各抗性芽經(jīng)單獨(dú)離體繁殖成活36株。

3玉米RIPs基因?qū)︸R鈴薯轉(zhuǎn)化.......25

3.1材料與方法.......25
3.2結(jié)果與分析.......26
3.3討論.......27
3.4小結(jié).......31
4RIPs基因在受體馬鈴薯中表達(dá)的分子檢測.......31
4.1材料與儀器設(shè)備.......31
4.2試驗(yàn)方法.......34
4.3結(jié)果與分析.......43
4.4討論.......50
4.5小結(jié).......51
5轉(zhuǎn)RIPs基因馬鈴薯抗病性鑒定.......51
5.1材料與方法.......51
5.2結(jié)果與分析.......55
5.3討論.......60
5.4小結(jié).......62

6結(jié)論

6.1以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓片轉(zhuǎn)化法獲得了5個卡那霉素抗性株系的36個化抗性株，建立的轉(zhuǎn)化體系遺傳轉(zhuǎn)化率為6.25%。6.2來自3個卡那霉素抗性株系的34個株的基因組中均擴(kuò)錯到了基因,經(jīng)Southern印跡分析證實(shí)各抗性株基因組合了2或4個拷貝RIPS基因;RT-PCR分析表明RIPS基因在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá),且RIPS基因在根中的表這量高于莖葉;蛋白提取物具有化RIPS產(chǎn)物。6. 3溫室盆栽試驗(yàn)證實(shí)有1個轉(zhuǎn)基因株系顯著提高了對由馬鈴薯塊莖的抗性;6.4離脫葉接種單生理小種懸浮液鑒定轉(zhuǎn)基因株系抗性,來自同一個株系的4個株均提高疫病;9個生理小種懸浮液混合物接種離脫葉鑒定3個轉(zhuǎn)RIPS基因株系,其中2個株系抗性得到顯著改善。本研究在馬鈴薯中表達(dá)核糖體失活蛋白基因以改善受體對真菌抗性為國內(nèi)首次報道。研究開辟了改善馬鈴薯抗病性的新途徑。

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7討論與展望

另外,所有核糖體失活蛋白都有較強(qiáng)免疫原性。限制了醫(yī)療上用作治療劑及植物基因工程應(yīng)用。但也有報道發(fā)現(xiàn)突變了的核糖體失活蛋白在保留其酶促活性的前提下免疫原性降低,這核糖體失活蛋白在植物基畫工程中的應(yīng)用掃清道路。再有,離體和異源表達(dá)均證明核糖體失活蛋白與幾了質(zhì)酶或葡聚糖酶么間有協(xié)同作用。而馬鈴薯恰恰有內(nèi)源性的質(zhì)酶和葡聚糖酶基因。因此,從協(xié)同作用考慮,核糖體失活蛋白基因在馬鈴薯中表達(dá)有著天然的優(yōu)勢,不失為提離受體馬鈴薯抗病性的一個有效途徑。

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參考文獻(xiàn)（略）

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本文編號：35034