發(fā)布時(shí)間：2024-05-21 03:40

　　從呋喃它酮代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮(5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ)衍生物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞中克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因,通過(G1y4Ser)3連接肽采用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體基因,p ET-22b(+)表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá),Ni親和柱進(jìn)行純化,制備得到抗AMOZ衍生物單鏈抗體,采用棋盤滴定實(shí)驗(yàn)優(yōu)化包被原包被濃度和單鏈抗體稀釋度,建立基于此單鏈抗體的AMOZ殘留間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法并對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:最佳包被抗原質(zhì)量濃度和單鏈抗體稀釋度分別為0.062 5μg/m L和20倍;建立的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法半抑制濃度為8.65μg/L,線性范圍為2.90～53.28μg/L,檢測限為1.48μg/L;除與原藥呋喃它酮有交叉反應(yīng)外,此單鏈抗體與其他硝基呋喃類抗生素及其代謝物交叉反應(yīng)率均小于0.1%,蝦肉樣品添加回收率為74.3%～86.6%;用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)免疫測定結(jié)果進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn),兩種方法相關(guān)性良好(R2=0.999 2),說明建立的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方...

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【部分圖文】：

圖2抗AMOZ衍生物scFv基因全序列

SOE-PCR擴(kuò)增電泳鑒定結(jié)果和陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的雙酶切鑒定和PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果如圖1所示。從圖1A可知，SOE-PCR擴(kuò)增后得到堿基長度約為750bp的scFv基因，與預(yù)期片段大小一致。從圖1B、C可知，陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和PCR擴(kuò)增后，都得到了約750bp大小的條帶，....

圖3重組scFv蛋白SDS-PAGE鑒定（A）和Westernblotting分析（B)

2.2抗AMOZ衍生物scFv表達(dá)、純化和活性鑒定從抗性平板上挑取抗AMOZ衍生物scFv陽性克隆菌的單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，以pET22b（+）載體的空菌作為對(duì)照，經(jīng)0.6mol/LIPTG24℃誘導(dǎo)表達(dá)7h后收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot....

圖4AMOZ衍生物scFv效價(jià)測定和抑制作用分析

從抗性平板上挑取抗AMOZ衍生物scFv陽性克隆菌的單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，以pET22b（+）載體的空菌作為對(duì)照，經(jīng)0.6mol/LIPTG24℃誘導(dǎo)表達(dá)7h后收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblotting分析，結(jié)果見圖3。SDS-PAGE結(jié)果可知，陽....

圖5NPAMOZ的icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3)

選擇2-NBA、3-NBA和4-NBA3種作為衍生劑，由圖6A可知，3種硝基苯甲醛衍生劑的衍生效果相差不大，因?yàn)槔L制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)用的競爭藥物為2-NPAMOZ，所以選擇2-NBA作為后續(xù)衍生條件優(yōu)化的衍生劑；加入2-NBA衍生劑25、50、100、200、250μL，考察衍生試劑....

本文編號(hào)：3979555