為了實(shí)現(xiàn)大西洋三文魚和虹鱒魚的物種摻假快速檢測(cè),本研究建立了一種基于雙重PCR（普通和熒光）的物種鑒定方法。通過(guò)序列分析,分別基于線粒體COⅠ和Cyt b基因設(shè)計(jì)大西洋三文魚和虹鱒魚特異性引物,驗(yàn)證引物的特異性并對(duì)雙重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,建立大西洋三文魚和虹鱒魚的雙重PCR快速鑒定方法。利用本研究設(shè)計(jì)的引物,僅大西洋三文魚和虹鱒魚可以分別擴(kuò)增出108 bp和207 bp的特異性條帶,而其他23種非目標(biāo)物種均未有擴(kuò)增條帶。經(jīng)驗(yàn)證,在雙重PCR反應(yīng)體系中,大西洋三文魚和虹鱒魚引物的最佳添加量分別為0.1和0.4μmol/L,熔解溫度分別約為81.5℃和85℃。利用該方法從29份市售"三文魚"樣品中檢測(cè)到6份大西洋三文魚和3份虹鱒魚,且與DNA條形碼比對(duì)結(jié)果一致。本研究建立的大西洋三文魚和虹鱒魚雙重PCR（普通和熒光）鑒定方法具有良好的特異性和適用性,為大西洋三文魚和虹鱒魚物種鑒定提供了可靠的技術(shù)手段。 

【文章來(lái)源】：現(xiàn)代食品科技. 2020,36(12)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

線粒體COⅠ和Cyt b基因中雙重PCR引物的相對(duì)位置

一般而言，線粒體基因組和核基因組均可以作為物種鑒定的目的基因。然而，與核基因組相比，線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、序列和組成比較保守、母系遺傳、無(wú)重組、單拷貝等特點(diǎn)[20]，已經(jīng)被廣泛用于水產(chǎn)類物種鑒定，包括鱸形目[15]、鱈形目[16]等多個(gè)不同族群的魚類品種。本研究通過(guò)大量的序列比對(duì)分析，分別基于COⅠ和Cyt b基因設(shè)計(jì)了大西洋三文魚和虹鱒魚物種特異性引物（表1）。引物配對(duì)和熔解溫度（Tm）是多重PCR體系建立的關(guān)鍵[21]。特異性引物需與目標(biāo)物種的堿基位點(diǎn)充分配對(duì)，而與非目標(biāo)物種存在一定數(shù)量的堿基位點(diǎn)錯(cuò)配，以減少非特異性擴(kuò)增[22]。各組引物Tm值相近則有利于多對(duì)引物在同一個(gè)反應(yīng)體系下擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的目標(biāo)序列[23]。本研究設(shè)計(jì)的2對(duì)引物，均與目標(biāo)物種序列完全配對(duì)。并且，大西洋三文魚特異性引物Salmo F-1和Salmo R-1與虹鱒魚分別有5個(gè)和4個(gè)錯(cuò)配堿基；虹鱒魚特異性引物Omyk F-12和Omyk R-3與大西洋三文魚均有2個(gè)錯(cuò)配堿基（圖1）。兩對(duì)引物Tm值均約為55.0℃（表1），表明兩對(duì)引物在雙重PCR體系中的最適退火溫度相同，有助于引物僅與目標(biāo)物種DNA結(jié)合，不與非目標(biāo)物種DNA進(jìn)行退火[24]。

2.2 雙重PCR反應(yīng)體系建立為建立最佳雙重PCR反應(yīng)體系，對(duì)引物反應(yīng)體系終濃度配比進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置（I）、（II）、（III）、（IV）四組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比。其中（I）組大西洋三文魚引物（10μmol/L）和虹鱒魚引物（10μmol/L）各加0.5μL;(II）組各加0.4μL和0.6μL;(III）組各加0.3μL和0.7μL;(IV）各加0.2μL和0.8μL。在普通PCR中，（I）、（II）和（III）擴(kuò)增的虹鱒魚特異性條帶均較淺，而（IV）擴(kuò)增的大西洋三文魚和虹鱒魚特異性條帶均較清晰（圖3）。在熒光PCR中，由（I）、（II）和（III）中虹鱒魚的熔解曲線可知，虹鱒魚的擴(kuò)增效率較低，而（IV）中大西洋三文魚和虹鱒魚的擴(kuò)增效率均較高（圖4）。因此本研究確定（IV）為最佳引物濃度配比。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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