近年來(lái),隨著對(duì)抗生素的濫用,食源性致病菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重。目前除了從管理上規(guī)范抗生素的使用,對(duì)規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)（clusterd regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）與耐藥性相關(guān)研究也在持續(xù)進(jìn)行。CRISPR-Cas作為一種天然免疫機(jī)制,因?yàn)槠洫?dú)特的免疫作用機(jī)理,目前常被用以基因編輯、耐藥性等方面研究。本文對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹,從其結(jié)構(gòu)、原理以及目前的研究趨勢(shì)對(duì)不同菌株間CRISPR系統(tǒng)與耐藥性、毒力因素進(jìn)行相關(guān)總結(jié),為防治食源性致病菌引起的食品安全問(wèn)題提供新思路。 

【文章來(lái)源】：食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào). 2020,11(24)

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

Vosik等[32]通過(guò)對(duì)美國(guó)本土沙門(mén)氏菌進(jìn)行CRISPR和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)比對(duì),耐藥分析發(fā)現(xiàn)分離株對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素(占分離株的58%),氨芐青霉素(50%),鏈霉素(占43%)和對(duì)增強(qiáng)素的中度或完全耐藥(占45%)表現(xiàn)出抗藥性,說(shuō)明食源性致病菌耐藥率逐漸上升,但是市面上抗生素有限,所以耐藥趨勢(shì)目前來(lái)說(shuō)十分嚴(yán)峻。對(duì)志賀菌株進(jìn)行CRISPR系統(tǒng)篩查,發(fā)現(xiàn)95%的志賀氏菌包含可信的CRISPR結(jié)構(gòu),對(duì)于包含這些結(jié)構(gòu)的志賀氏菌,它們的多重耐藥率可達(dá)到53.33%,并且其間隔序列的多樣性與重復(fù)序列的保守狀態(tài)與耐藥性之間存在一定關(guān)聯(lián)[33]。張冰[34]在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),通過(guò)電轉(zhuǎn)導(dǎo)入耐藥基因的志賀菌CRISPR系統(tǒng)并沒(méi)有產(chǎn)生較大變化,或者是單核苷酸多動(dòng)態(tài)性變化,并且發(fā)現(xiàn)在高濃度氯霉素作用下,會(huì)激活志賀氏菌外排泵蛋白使其出現(xiàn)耐藥性,但這種變化并不會(huì)影響志賀氏菌的CRISPR系統(tǒng)。擁有CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌耐藥性相對(duì)來(lái)說(shuō)也比較高,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),包含CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌對(duì)土霉素(97.7%)、磺胺-6-甲氧嘧啶(96.9%)、強(qiáng)力霉素(90.0%)、阿莫西林(83.1%)和利福平(83.8%)均體現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性[35]。CRISPR陽(yáng)性的大腸桿菌菌株的多重耐藥率明顯高于陰性菌株,側(cè)面反映出,在大腸桿菌中可能頻繁出現(xiàn)不同菌株間的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,并且這一轉(zhuǎn)移過(guò)程并沒(méi)有被CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾,所以才會(huì)出現(xiàn)多重耐藥的CRISPR陽(yáng)性菌株[36]�？傮w來(lái)說(shuō),存在CRISPR序列的菌株,基本都會(huì)出現(xiàn)較高的多重耐藥性的情況,對(duì)于此類(lèi)多重耐藥菌株的出現(xiàn)原因與CRISPR之間關(guān)系也值得深入研究探討。另外,除了探究食源性致病菌CRISPR與耐藥性之間的關(guān)系,也有研究利用CRISPR-Cas9降低食源性致病菌的抗生素耐藥率。董海思[36]研究針對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥大腸桿菌的情況,利用CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù),對(duì)大腸桿菌中多重耐藥質(zhì)粒中的cfr基因進(jìn)行敲除,結(jié)合效率為0.22%;通過(guò)同源重組不依賴(lài)宿主菌的接合效率可達(dá)1.43%。通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)CRISPR系統(tǒng)完整并且存在cas基因簇時(shí),耐藥基因mec A的水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象會(huì)大幅度受到抑制,可以有效降低金黃色葡萄球菌的耐藥率問(wèn)題[37],說(shuō)明cas基因在金黃色葡萄球菌中對(duì)降低耐藥性有一定影響。但是在大腸桿菌中,cas基因在CRISPR陽(yáng)性和陰性菌株中并無(wú)明顯差異,并且耐藥質(zhì)�？梢栽贑RISPR陽(yáng)性菌種中傳播[38]。對(duì)于志賀氏菌來(lái)講,其耐藥性與毒力作用,在一定情況中與CRISPR在統(tǒng)計(jì)學(xué)研究方面存在一定關(guān)系[39],并且發(fā)現(xiàn)是由多個(gè)CRISPR系統(tǒng)協(xié)同作用而發(fā)生的,相比于肺炎鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)阻止毒力因子攝入,目前志賀氏菌CRISPR與毒力作用之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步深入研究。

食源性致病菌通常獲得毒力基因來(lái)源于外源噬菌體和病毒等方式,例如在致病性金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌基因組中會(huì)發(fā)現(xiàn)毒力因子編碼基因和溫和噬菌體的基因[42]。間隔序列可以防御外來(lái)遺傳物質(zhì)的入侵,所以在一定程度上會(huì)阻止毒力因子的獲取,干擾毒力因子在致病菌之間進(jìn)行傳播。Yang等[43]研究中,揭露了金黃色葡萄球菌08BA02176和MSHR1132的5個(gè)間隔序列與來(lái)自噬菌體或質(zhì)粒的外源遺傳序列同源,甚至含有與某些噬菌體含有編碼PVL毒素的luk PV基因的部分基因組相同的間隔序列。除此以外,Ido等[44]發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌強(qiáng)毒性菌株如果缺失CRISPR序列或是存在較短CRISPR序列,其自身則會(huì)增強(qiáng)毒性,另外發(fā)現(xiàn)如果CRISPR系統(tǒng)中缺失cas1基因簇,則腸球菌毒性會(huì)增強(qiáng),導(dǎo)致致病島增多。CRISPR降低食源性致病菌毒力的原因在于可以利用反義RNA作用影響免疫原蛋白膜的表達(dá),不過(guò)此原理中的RNA在不同食源性致病菌中千差萬(wàn)別,并沒(méi)有統(tǒng)一的反義RNA[45,46]。通過(guò)對(duì)CRISPR-Cas9的了解,發(fā)現(xiàn)了cas9基因簇是食源性致病菌降低毒力因素的關(guān)鍵,cas9在毒力方面的獨(dú)特作用已經(jīng)被提出[47],并且cas9如何共同決定毒力的分子基礎(chǔ)已經(jīng)被揭示。cas操縱子包含至少3個(gè)基因(cas9、cas1、cas2)(圖3A),基于csn2和cas4基因型分別出現(xiàn)在Ⅱ-A和Ⅱ-B型中;其中處理過(guò)的cr RNA和較短版本的tracr RNA,很可能是由處理較長(zhǎng)tracr RNA或來(lái)自第2個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的(圖3B),最終負(fù)責(zé)與目標(biāo)DNA的相互作用;tracr RNA與轉(zhuǎn)錄目標(biāo)有很多相似的同源性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄RNA出現(xiàn)被降解的可能(圖3C)[48]。總的來(lái)說(shuō),CRISPR-Cas9應(yīng)用范圍十分廣泛,對(duì)于降低食源性致病菌毒力因素,降低致病菌耐藥性至關(guān)重要。對(duì)于耐藥基因和毒力基因溯源性問(wèn)題進(jìn)行研究,可以從根本上抑制致病菌帶來(lái)的食品安全健康問(wèn)題。3 討論與展望

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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