發(fā)布時(shí)間：2017-01-05 08:27

1   引言 

1.1   選題背景
地下鼠是一種終生營(yíng)地下洞道生活的一種嚙齒類動(dòng)物，地下洞道中的環(huán)境是一種特殊的低氧環(huán)境，若遭遇洪水、暴雨等極端條件，洞道中的氧含量會(huì)大幅降低。常年進(jìn)行地下生活的地下鼠，長(zhǎng)期進(jìn)化產(chǎn)生了一些生物學(xué)適應(yīng)特征，如血氧含量增高[1,2]、紅細(xì)胞數(shù)量增多、肺泡中氣體擴(kuò)散能力增強(qiáng)、血紅蛋白含量增高、血液攜氧能力增強(qiáng)[3,4]、骨骼肌毛細(xì)血管密度增大[5,6]、紅細(xì)胞體積減小[7-9]等，以應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境。 研究發(fā)現(xiàn)：地下哺乳動(dòng)物，如鼴形屬鼠，Spalax 鼠是一種壽命較長(zhǎng)（>20 年）的嚙齒類動(dòng)物，未在行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)方面發(fā)現(xiàn) Spalax 鼠有任何衰老跡象，同樣，也未在高齡 Spalax 鼠中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染或發(fā)炎跡象，即 Spalax 鼠具有抗衰老、長(zhǎng)壽的特性。同樣，在 40 年研究調(diào)查中，從未在剛從外地捕獲或飼養(yǎng)在籠子里的 Spalax 鼠個(gè)體中發(fā)現(xiàn)其患有癌癥，以及在 Spalax 鼠個(gè)體中，人為注射致腫瘤藥物，也并未發(fā)現(xiàn)其患有腫瘤，即 Spalax 鼠具有抗癌性，而對(duì) C57BL/6品系的小鼠而言，因疾病死亡的個(gè)體中，70%的死于癌癥。并且在其它地下鼠，例如裸鼴鼠的研究中，也發(fā)現(xiàn)其具有長(zhǎng)壽和抗腫瘤的特性[10]。 在 Spalax 鼠抗腫瘤特性中，研究較多的是 p53 的一個(gè)抗腫瘤機(jī)制。有研究表明，在一定程度的低氧脅迫下，p53 可促進(jìn)細(xì)胞周期停滯，并通過與一個(gè)特定的 DNA 結(jié)合域結(jié)合對(duì)受損 DNA 進(jìn)行修復(fù)[10]。另一方面，通過 p53 調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡應(yīng)答低氧脅迫[11]。 環(huán)境低氧會(huì)對(duì)生物機(jī)體產(chǎn)生一定的損傷，機(jī)體缺氧將導(dǎo)致自身功能障礙，尤其是腦組織的缺氧會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重影響，如凋亡（apoptosis）。在低氧應(yīng)答過程中，低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor, HIF）作為核心因子，有許多下游調(diào)控基因，其通過調(diào)節(jié)不同的通路對(duì)低氧進(jìn)行應(yīng)答。p53 是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子（tumor suppressor gene 53, TP53/ p53），同時(shí)也是 HIF 誘導(dǎo)凋亡的一個(gè)下游靶基因，長(zhǎng)期以來，受到科學(xué)家的極大關(guān)注。 
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1.2   與低氧誘導(dǎo)因子相關(guān)的研究
氧氣是維持生命有機(jī)體健康生長(zhǎng)、繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生物體進(jìn)行新陳代謝必不可少的一種非生物因子。當(dāng)環(huán)境中氧氣濃度降低時(shí)，即造成一種低氧環(huán)境。若低氧中的氧氣濃度不足以維持生命體的正常活動(dòng)，低氧可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一系列生理生化的不良反應(yīng)。機(jī)體中的缺氧情況可以分為三種類型。1）外界環(huán)境中氧含量低，機(jī)體不能從外界環(huán)境中獲取足夠的氧氣，如高原環(huán)境；2）外界環(huán)境中氧含量充足時(shí)，一些疾病所造成的機(jī)體自身不能充分地利用氧氣，如哮喘；3）機(jī)體自身對(duì)氧氣的消耗量過多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生物體生理活動(dòng)所需，如劇烈運(yùn)動(dòng)[18]。機(jī)體缺氧可導(dǎo)致與復(fù)制相關(guān)的 DNA 發(fā)生損傷，例如增加點(diǎn)突變率、顛換、刪除，并降低 DNA 的修復(fù)活性[19]。通過低氧暴露處理，腫瘤細(xì)胞的低氧微環(huán)境可加速腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]，同時(shí)也可加速非病理細(xì)胞的生長(zhǎng)[21]。另外，機(jī)體缺氧可能會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖——激活緊密耦合的 ATM 和 ATR 激酶的活性，并且可修飾組蛋白 H2AX，H2AX 可促使 DNA 修復(fù)的反應(yīng)[22, 10]。 然而，周圍外環(huán)境中的低氧環(huán)境不一定在第一時(shí)間對(duì)機(jī)體造成損傷，也不一定使機(jī)體產(chǎn)生缺氧現(xiàn)象。生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，在面對(duì)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)可以隨時(shí)做出適應(yīng)性的反應(yīng)，這種情況多體現(xiàn)于生物體把能量聚集在腦組織和肌肉中，以此維持生命的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。相反，在低氧環(huán)境中，攝食、消化、運(yùn)動(dòng)等其它消耗能量的生理活動(dòng)很可能會(huì)威脅機(jī)體的安全。因此，在應(yīng)答低氧時(shí)，生物體減少食物的攝取、四肢的運(yùn)動(dòng)也成為了一種應(yīng)激性的表現(xiàn)[23]。低氧是一種可以引起機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的刺激源，當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)，低濃度的氧氣不能作為機(jī)體獲取充足能量的一種來源，但是，機(jī)體為了應(yīng)對(duì)能量的缺少，就會(huì)相應(yīng)地減少四肢的運(yùn)動(dòng)，以此減少能量的過度消耗，保證機(jī)體的安全[18]。 機(jī)體缺氧可對(duì)組織造成一定程度的損傷，如作為重要靶器官的腦組織。機(jī)體缺氧也還可對(duì)其它器官、系統(tǒng)造成一定程度的傷害，如心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等[24]。當(dāng)機(jī)體患有缺氧缺血病癥時(shí)，腦組織海馬區(qū)、大腦皮層均為缺氧較敏感區(qū)域，即易受損腦區(qū)[25]。 
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2   急性低氧暴露后復(fù)氧對(duì)體重變化的影響 

低氧刺激各個(gè)臟器和系統(tǒng)，造成組織或細(xì)胞的氧供應(yīng)不足，導(dǎo)致組織的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和生理調(diào)節(jié)[1]，同時(shí)也會(huì)對(duì)體重產(chǎn)生一定的影響。體重是生物體基礎(chǔ)而重要的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，受到諸多因素（如食物豐富度、食物可利用性、生理狀態(tài)等）的影響，其中亦包括不良環(huán)境壓力因素（如急性低氧環(huán)境）。個(gè)性化（personality）是指動(dòng)物個(gè)體面對(duì)同一情景時(shí)所表現(xiàn)出的穩(wěn)定行為差異[2]。動(dòng)物個(gè)性化的研究通常采用鏡像圖像刺激（mirror-image  stimulation），MIS 是不同種類的動(dòng)物在面對(duì)一面鏡子時(shí)研究它們的反應(yīng)，而這種反應(yīng)代表此動(dòng)物的社會(huì)行為及其侵略行為[3]。 以往的研究表明，低氧暴露對(duì)肥胖大鼠的體重產(chǎn)生顯著影響，兩種不同低氧暴露處理組肥胖大鼠的體重相比對(duì)照組顯著降低[4]。鏡像刺激與動(dòng)物和同類發(fā)生的視覺沖突造成的刺激相類似，但是，二者的方法卻不同。視覺沖突是通過其他動(dòng)物個(gè)體與自身不同的視覺效果[5,6]，而鏡像刺激則是通過動(dòng)物自身的鏡像。我們通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行鏡像刺激分析行為特征，進(jìn)而區(qū)分出不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)性化特征[7]。在與另一個(gè)動(dòng)物研究攻擊行為，以及直接對(duì)抗中，使用MIS的優(yōu)點(diǎn)在于除了視覺刺激和缺乏物理沖突之外，基本上消除其了它因素[8]。 本研究以棕色田鼠和布氏田鼠為對(duì)象，測(cè)定并選擇個(gè)性化得分在0.2-0.6的實(shí)驗(yàn)個(gè)體，在氧艙內(nèi)設(shè)置急性低氧暴露處理，在不同的復(fù)氧時(shí)間測(cè)定其體重，旨在研究急性低氧暴露后復(fù)氧對(duì)地下鼠與地面鼠體重變化的影響，以及在低氧暴露后復(fù)氧條件下個(gè)性化與對(duì)體重的關(guān)系。 

2.1   材料與方法
實(shí)驗(yàn)用健康成年雄性棕色田鼠 12 只，體重在 30-49 g，鼠齡在 3 個(gè)月或以上，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁殖生長(zhǎng)，主要以兔飼料和鼠飼料飼養(yǎng)，并以胡蘿卜輔助飼養(yǎng)，提供充足的水源，以鋸末作墊料，棉花作巢穴。飼養(yǎng)溫度控制在 20-24  ℃，光周期為 14 L:10 D（光照時(shí)間為 8:00-22:00）。實(shí)驗(yàn)用健康成年雄性布氏田鼠 12 只，體重在 30-49  g,鼠齡在 3 個(gè)月或以上,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁殖生長(zhǎng)，飼養(yǎng)于動(dòng)物飼養(yǎng)箱內(nèi)，以鋸末作墊料，棉花作巢穴。飼養(yǎng)溫度控制在 20-24  ℃，光周期為 14 L:10 D（光照時(shí)間為 8:00-22:00）。 
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2.2   結(jié)果
12 只雄性棕色田鼠和 12 只雄性布氏田鼠的個(gè)性化得分呈正態(tài)分布（L. mandarinus  ：0.32 ± 0.16；L. brandtii  ：0.41 ± 0.14）（圖 2.1） 去除兩側(cè)極端個(gè)性化得分的個(gè)體，用于實(shí)驗(yàn)的個(gè)體得分如下（表 2.1）所示。低氧處理組（0.36 ± 0.06）和常氧處理組（0.46 ± 0.04）布氏田鼠的個(gè)性化得分差異不顯著（t =-1.236, df =10, P =0.245），而棕色田鼠低氧處理組（0.39 ± 0.06）和常氧處理組（0.29 ± 0.03）的個(gè)性化得分差異不顯著（t =-1.440, df =10, P =0.181）（圖 2.2）。急性低氧后復(fù)氧時(shí)間對(duì)棕色田鼠和布氏田鼠的體重影響相似（圖 2.4，圖
2.5）。急性低氧處理對(duì)棕色田鼠和布氏田鼠的體重均呈現(xiàn)抑制作用，隨復(fù)氧時(shí)間增加體重逐漸恢復(fù)，至 12-24 h 左右恢復(fù)至初始體重水平。 
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3  急性低氧暴露后復(fù)氧對(duì) p53 和 HIF-1α 基因表達(dá)的影響 ........ 23 
3.1  材料與方法 .... 23 
3.1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ....... 23 
3.1.2  實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及試劑........ 23 
3.1.3  實(shí)驗(yàn)方法 ....... 24 
3.1.4  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析........ 31 
3.2  結(jié)果 ...... 31
3.3  討論 ...... 53 
3.3.1   HIF-1α m RNA 表達(dá)量變化 ........ 53 
3.3.2   p53 m RNA 表達(dá)量變化 .... 53 
3.3.3   HIF-1α 和 p53 相關(guān)性分析 ........ 54 
3.3.4   HIF-1α 和 AI 相關(guān)性分析 .......... 54 
4  急性低氧暴露后復(fù)氧對(duì)海馬區(qū) CA1 細(xì)胞的影響 ........57 
4.1  材料與方法 .....57 
4.2  結(jié)果 ...... 61 
4.2.1  兩種鼠不同復(fù)氧時(shí)間細(xì)胞凋亡切片 .... 61 
4.2.2  腦組織海馬區(qū)凋亡情況 .... 63 
4.2.3  HIF-1α 與細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析........... 65 
4.3  討論 ...... 67 
5  全文總結(jié) ............ 69 
5.1  主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果 ........ 69 
5.2  主要結(jié)論 ........ 70 
5.3  創(chuàng)新點(diǎn) ............ 71 

4  急性低氧暴露后復(fù)氧對(duì)海馬區(qū) CA1 細(xì)胞的影響 

機(jī)體缺氧可對(duì)組織造成一定程度的損傷，如腦組織，即機(jī)體缺氧的重要靶器官。當(dāng)機(jī)體患有缺氧缺血病癥時(shí)，，腦組織海馬區(qū)、大腦皮層均為缺氧較敏感區(qū)域，即易受損腦區(qū)。腦組織對(duì)低氧極為敏感，當(dāng)腦組織受到低氧刺激時(shí)，大量的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生生理性病變，如細(xì)胞凋亡，以此來躲避低氧對(duì)神經(jīng)的損傷。另外，腦組織作為機(jī)體最重要的部分，在面臨低氧環(huán)境時(shí)，機(jī)體會(huì)對(duì)腦組織產(chǎn)生一些低氧補(bǔ)償機(jī)制[1]，避免腦組織在機(jī)體遭受低氧脅迫時(shí)受到損傷。 以往的研究表明，當(dāng)一些實(shí)體腫瘤細(xì)胞遭受低氧的脅迫時(shí)，低氧處理后的野生型 p53 的上調(diào)，可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。在實(shí)體腫瘤細(xì)胞中，低氧作為一種選擇性脅迫條件，使 p53 發(fā)生突變，從而破壞細(xì)胞凋亡途徑。腫瘤細(xì)胞中突變的p53 有可能累積，或是被修復(fù)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖或是減少血管細(xì)胞的生成。低氧作為一種環(huán)境脅迫，可挑選一些特定的 p53 突變體，這些突變體可確保細(xì)胞能夠抵抗因低氧而誘導(dǎo)的凋亡[3]。在急性極端低氧處理?xiàng)l件下，腦組織海馬區(qū)的細(xì)胞受到一定程度的損傷，一方面可以通過 p53 與受損的 DNA 結(jié)合進(jìn)行修復(fù)，另一方面也可以通過 p53 促使受損嚴(yán)重的細(xì)胞進(jìn)行程序性死亡，兩種方法都可以有效地避免應(yīng)激性低氧帶來的嚴(yán)重傷害[4]。 迄今為止，大多的研究都停留細(xì)胞凋亡過程中的通路及機(jī)制，而有關(guān)細(xì)胞凋亡的誘發(fā)機(jī)制，如低氧暴露下凋亡途徑的分子機(jī)制則報(bào)道較少。本研究通過低氧暴露后復(fù)氧對(duì)地下鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞的影響，揭示低氧對(duì)地下鼠和地面鼠細(xì)胞凋亡的影響差異。

 

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總結(jié)

本論文以毛足田鼠屬（Lasiopodomys）的兩個(gè)物種，棕色田鼠和布氏田鼠為研究對(duì)象，采用比較生物學(xué)方法，在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)三個(gè)水平研究了其在低氧暴露下個(gè)性化與體重變化的關(guān)系、腦組織海馬區(qū) CA1 區(qū)域細(xì)胞凋亡、腫瘤抑制基因 p53 和 HIF-1a 的表達(dá)情況，旨在探討作為地下鼠的棕色田鼠與地面鼠布氏田鼠在腫瘤抑制基因 p53 表達(dá)方面的差異，初步揭示了地下鼠抗腫瘤的特性。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 
1）成功篩選出具有相近個(gè)性化特征的棕色田鼠和布氏田鼠。 基于礦場(chǎng)和鏡像刺激實(shí)驗(yàn)，利用視頻自動(dòng)分析軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)錄像和數(shù)據(jù)采集，Smarat 3.0 分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)性化，然后選擇其中個(gè)性化得分在 0.2-0.6 的個(gè)體，用于后續(xù)研究。 
2）低氧暴露下，棕色田鼠和布氏田鼠的體重變化與篩選出的相近個(gè)性化得分間相關(guān)性不顯著（棕色田鼠：r =0.149，P =0.778；布氏田鼠：r =0.064，P =0.905）。說明經(jīng)過個(gè)性化的篩選，成功減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)性化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 
3）無論是在低氧還是在常氧處理下，棕色田鼠和布氏田鼠的體重變化趨勢(shì)相似。棕色田鼠低氧組、棕色田鼠常氧組、布氏田鼠低氧組、布氏田鼠常氧組等 4 組動(dòng)物的體重均呈現(xiàn)先降低后恢復(fù)的現(xiàn)象（P =0.015），低氧暴露顯著地降低了兩種鼠的體重（P =0.038），而鼠種之間（P =0.956）或者鼠種與低氧處理間的交互作用（P =0.394）則均不顯著。 
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：234723