1.引言

種子作為引種馴化的一個(gè)基本單位，在優(yōu)良種質(zhì)和特異基因的遺傳以及保持方面起著不可替代的作用。對(duì)于大多數(shù)植物而言，種子萌發(fā)過(guò)程是指種子在植株上發(fā)育成熟并且脫離母體植株以后，于適宜的溫度下吸收水分直至胚軸（胚根）突破種皮期間發(fā)生一系列生理生化變化的過(guò)程。同時(shí)，發(fā)育成熟并脫離母體植株以后的植物種子可以分為兩種：具有休眠期和不具有休眠期。具有休眠特性的種子成熟以后在短時(shí)間內(nèi)難以萌發(fā)（即所謂的休眠現(xiàn)象），只有經(jīng)過(guò)物理（例如低溫層積）或者化學(xué)（例如 GA 等化學(xué)藥劑誘導(dǎo)）的方法打破其休眠狀態(tài)之后，并給以適當(dāng)?shù)陌l(fā)芽條件（比如充足的水分，適宜的溫度、光照、氧氣等）才能萌發(fā)；另外，即使淺休眠或者不具有休眠特性的物種其種子能在植株上萌發(fā)的現(xiàn)象也是非常罕見(jiàn)的。但是像禾本科作物的玉米、小麥、水稻、高粱、燕麥等，以及豆科的大豆、菜豆等曾被報(bào)道過(guò)種子在植株上萌發(fā)的現(xiàn)象。另外還有松科（如喬松）、馬鞭草科（海欖雌）、紫金�？疲ㄈ缤┗�(shù)）、漆樹(shù)科（芒果）、茄科（辣椒、茄子、番茄等）、十字花科（擬南芥、大白菜、油菜、甘藍(lán)等）、葫蘆科（黃瓜、西瓜、甜瓜、佛手瓜等）等也報(bào)道了種子提前萌發(fā)的現(xiàn)象。像這種種子在母體植株上經(jīng)過(guò)一定程度的發(fā)育以后在脫離母體植株以前即萌發(fā)的現(xiàn)象被叫做胎生或者胎萌。這是作物的一種品種特性，并受外界環(huán)境條件的影響。

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2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

LA0617（ABA-缺失型突變體）：由美國(guó)戴維斯番茄種質(zhì)資源中心（TGRC）提供，也叫萎蔫型突變體；LA2895（GA-缺失型突變體）：由美國(guó)戴維斯番茄種質(zhì)資源中心（TGRC）提供，植株深綠色，矮化；番茄 rin 突變體:由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供，含有成熟抑制基因（rin），大花萼、果實(shí)表現(xiàn)遲熟性狀，種子具有胎萌特性；對(duì)照品種 :由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供, 果實(shí)各發(fā)育階段特征明顯，種子無(wú)過(guò)早萌發(fā)的特點(diǎn)。生化試劑：ABA(美國(guó) sigma)、聚乙二醇 6000(天津博迪化工公司)、 CaCl2•2H2O(天津華鑫試劑公司)試劑盒：cDNA 第一鏈合成試劑盒、T easy-Vector、Plant easy RNA 提取試劑(均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(均購(gòu)自上海生工)；載體及菌株：E.coli DH5α、農(nóng)桿菌 EHA105、PBI121、pTCK303 由本實(shí)驗(yàn)室保存

2.2 試驗(yàn)方法

在開(kāi)花期，對(duì)番茄 rin 突變體的花序進(jìn)行掛牌標(biāo)記。根據(jù)連續(xù)幾年對(duì)胎萌現(xiàn)象發(fā)生規(guī)律的調(diào)查，將番茄開(kāi)花授粉之后 30、35、40 天，無(wú)任何病蟲(chóng)害、發(fā)育良好的果實(shí)切開(kāi)，觀察有無(wú)種子發(fā)生胎萌并進(jìn)行記錄；而對(duì)于開(kāi)花授粉之后 45、50、55 天的番茄果實(shí)，挑選無(wú)任何病蟲(chóng)害、發(fā)育良好、種子發(fā)生胎萌的番茄果實(shí)剝開(kāi)，，將果實(shí)里的種子用鑷子小心剝離出來(lái)，統(tǒng)計(jì)已經(jīng)胎萌和未胎萌的種子數(shù)目，計(jì)算這三個(gè)發(fā)育階段的果實(shí)內(nèi)種子的萌發(fā)率。（每個(gè)階段的果實(shí)取 5 個(gè)，三次重復(fù)，用 Duncan 統(tǒng)計(jì)計(jì)算萌發(fā)率）。采收部分開(kāi)花授粉之后 55 天的果實(shí)，置于常溫下一段時(shí)間，或者將開(kāi)花授粉之后 55 天的果實(shí)進(jìn)行特殊標(biāo)記留于植株上一段時(shí)間，觀察調(diào)查統(tǒng)計(jì)其果實(shí)內(nèi)種子胎萌的數(shù)目。

3 結(jié)果與分析 .................... 31 

3.1 番茄 rin 突變體生理特性分析 .............. 31
3.2 番茄 rin 突變體 rin 的擴(kuò)增、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化......... 40
4.討論 ........................ 50 
4.1 番茄果實(shí)組織對(duì)種子胎萌的抑制作用.......... 50
4.2 激素缺失（ABA）對(duì)種子休眠和萌發(fā)的影響................... 50
4.3 番茄 rin 突變體種子胎萌的原因分析.................. 51
4.4 轉(zhuǎn)錄因子 LeMADS-rin 在 rin 突變體種子胎萌中的角色............ 52
4.5 工作展望 ..................... 53
4.6 創(chuàng)新點(diǎn) .............. 54
5 結(jié)論............... 55 

4.討論

4.1 番茄果實(shí)組織對(duì)種子胎萌的抑制作用

一般而言，像茄科的番茄、茄子、辣椒及葫蘆科的西甜瓜，其發(fā)育中的種子在果實(shí)內(nèi)難以萌發(fā)，但是當(dāng)把番茄種子從果實(shí)內(nèi)取出，去掉種子表面的膠黏物質(zhì)并置于水中孵育時(shí)，種子均能正常萌發(fā)[133]，本試驗(yàn)的結(jié)果也證明了此結(jié)論；且隨著種子成熟度的增加，其萌發(fā)率越來(lái)越高。這表明番茄果實(shí)組織能夠抑制發(fā)育中的種子在果實(shí)內(nèi)的萌發(fā)，此結(jié)論也與 Welbaum和 Bradford 對(duì)甜瓜種子的研究結(jié)論相一致，即果實(shí)組織對(duì)種子的早熟萌發(fā)（胎萌）具有制作用，并且果實(shí)組織內(nèi)相對(duì)高的滲透勢(shì)會(huì)影響種子在果實(shí)內(nèi)的萌發(fā)趨勢(shì)[44,72,74]。根據(jù)番茄 rin 突變體胎萌現(xiàn)象的跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)其發(fā)育中的種子在果實(shí)內(nèi)的萌發(fā)最早發(fā)生在開(kāi)花授粉之后 45 天左右的部分果實(shí)內(nèi)，此時(shí)只有零星幾個(gè)種子在果實(shí)內(nèi)萌發(fā)，大部種子的萌發(fā)被抑制�。浑S著果實(shí)的繼續(xù)發(fā)育，種子在果實(shí)內(nèi)萌發(fā)的數(shù)量越來(lái)越多，胎萌趨勢(shì)越來(lái)越明顯。這可能與番茄果實(shí)環(huán)境的變化（本試驗(yàn)中體現(xiàn)為果實(shí)內(nèi)滲透摩爾濃度）有一定的相關(guān)性。并且番茄果實(shí)除了提供抑制種子在果實(shí)內(nèi)萌發(fā)的滲透環(huán)境，果實(shí)組織內(nèi)也含有與種子休眠和萌發(fā)密切相關(guān)的植物激素，即 ABA。

4.2 激素缺失（ABA）對(duì)種子休眠和萌發(fā)的影響

休眠是種子在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展起來(lái)的一種適應(yīng)性特征，它是種子渡過(guò)惡劣環(huán)境、選擇合適的氣候條件以及棲居地、繁衍下一代的保證。有的種子在休眠過(guò)程中繼續(xù)發(fā)育完成其后熟進(jìn)程，為下一代種子萌發(fā)做好準(zhǔn)備。對(duì)種子休眠類(lèi)型的研究以及為打破休眠、降低其休眠程度所作的種種嘗試都極大的提高了種子的萌發(fā)率，例如通過(guò)沙藏處理、機(jī)械摩擦以及硫酸浸泡等打破由種皮引起的外休眠；通過(guò)噴施外源 GA、冷藏與 PEG 的結(jié)合破除由胚引起的內(nèi)休眠等[133]。休眠現(xiàn)象的產(chǎn)生受到大量遺傳因素與環(huán)境因子的影響，根據(jù)引起休眠的原因或者休眠程度可以分為初生休眠（primary dormancy）和次級(jí)休眠（secondary dormancy）。初生休眠是由于胚的休眠而引起的，此類(lèi)休眠的種子即使提供適宜的環(huán)境條件也不能萌發(fā)；而次級(jí)休眠是指由于環(huán)境條件不適而引起的種子被迫休眠。種子的休眠與種子或者母體植株內(nèi)ABA的含量或者種子各部分結(jié)構(gòu)對(duì) ABA 的敏感性存在著很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。
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5 結(jié)論

本試驗(yàn)從番茄果實(shí)和種子的發(fā)育特點(diǎn)入手，研究了番茄 rin 突變體種子早熟萌發(fā)現(xiàn)象的生理機(jī)制；并對(duì) LeMADS-rin 進(jìn)行了擴(kuò)增、分析及轉(zhuǎn)化，主要結(jié)論如下：（1）總結(jié)了番茄 rin 突變體種子胎萌發(fā)生的規(guī)律。番茄 rin 突變體在開(kāi)花授粉之后 45 天左右時(shí)，部分果實(shí)內(nèi)的種子開(kāi)始萌發(fā)，隨著果實(shí)和種子繼續(xù)發(fā)育，果實(shí)內(nèi)萌發(fā)的種子胚根伸長(zhǎng)，萌發(fā)種子數(shù)逐漸增多。到開(kāi)花授粉之后 55 天時(shí)，胎萌種子所占的比例由最初的 7%增至15%左右。如果到采收階段，果實(shí)仍然保留在母體植株上或者采收后置于常溫下一段時(shí)間，胎萌種子繼續(xù)增多，比例能達(dá)到 45%左右。并且此時(shí)，果實(shí)內(nèi)種子周?chē)哪z原物質(zhì)被消耗殆盡，出現(xiàn)小的空腔。（2）番茄果實(shí)組織對(duì)種子在果實(shí)內(nèi)的萌發(fā)具有抑制作用。將正在發(fā)育中的番茄種子每隔特定時(shí)間段取出，并去掉種子周?chē)哪z原物質(zhì)，置于水中孵育 7 天，各發(fā)育階段的種子均表現(xiàn)出相應(yīng)的萌發(fā)能力并呈現(xiàn)出不同的萌發(fā)率；將發(fā)育中的種子重新放回果實(shí)膠原物質(zhì)中離體培養(yǎng)時(shí)，種子萌發(fā)受到抑制；當(dāng)這些不能萌發(fā)的種子重新置于水中時(shí)，又恢復(fù)相應(yīng)的萌發(fā)能力。這表明番茄果實(shí)組織對(duì)未熟種子的萌發(fā)具有抑制作用。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：169267