本文關(guān)鍵詞：鱸鯉免疫相關(guān)基因的克隆及日糧蛋白水平對(duì)其表達(dá)量的影響

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【摘要】：本試驗(yàn)對(duì)鱸鯉幼魚Defensin、Hepcidin、TNF-a和IL-10等4個(gè)免疫相關(guān)基因完整的編碼區(qū)序列進(jìn)行了克隆和分析,并研究不同蛋白水平日糧飼喂鱸鯉幼魚后,4種免疫基因在各組織中表達(dá)模式；另外為篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因,探討了常用管家基因EF-1a、B2M, ODC, β-actin和GAPDH基因在同等試驗(yàn)條件下在多種組織表達(dá)穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果充實(shí)和拓展了鱸鯉營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)研究資料,為鱸鯉健康養(yǎng)殖提供了試驗(yàn)依據(jù)。試驗(yàn)采用克隆、測(cè)序等基本方法獲得相關(guān)免疫基因序列。采用單因子方案設(shè)計(jì),選擇480尾體質(zhì)健康、平均體重在(15.24±1.1)g鱸鯉幼魚,隨機(jī)分為4組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)40尾,分別飼喂蛋白質(zhì)水平為37.41%(I)、40.10%(Ⅱ)、44.34%(Ⅲ)、49.20%(Ⅳ)的試驗(yàn)日糧。80d試驗(yàn)期后,每組隨機(jī)挑選6尾魚,采集大腦、腮、頭腎、脾臟、肝臟、后腸、皮膚和心臟等組織,采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)樣品中各基因表達(dá)量,并用RefFinder和geNorm軟件分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性。結(jié)果表明：1.Hepcidin、TNF-a、Defensin、IL-10基因CDS區(qū)序列：4種基因全長(zhǎng)分別為282、711、204、540bp；分別編碼93、236、67、179個(gè)氨基酸；信號(hào)肽切割位點(diǎn)分別在24～25、50-51、24～25和22-23位間。各基因編碼氨基酸進(jìn)化樹與形態(tài)分類學(xué)地位基本一致,預(yù)測(cè)的編碼蛋白質(zhì)分子量分別為10.6kDa、26.4kDa, 7.2kDa和20.9kDa；等電點(diǎn)為6.39、5.25、8.22和8.42；Defensin編碼蛋白為疏水性蛋白質(zhì),其他基因編碼蛋白為親水性蛋白質(zhì)。2.沒(méi)有單一穩(wěn)定的內(nèi)參基因可以適用于不同蛋白水平日糧飼喂的各組鱸鯉不同組織中的表達(dá)分析。通過(guò)Reffinder分析可知,EF-1α在不同組織間表達(dá)最穩(wěn)定,最適合做單一內(nèi)參基因；在不同組間同一組織中最穩(wěn)定表達(dá)基因不同,肝臟和皮膚中為EF-1a,后腸、脾臟、腮、心臟和頭腎為B2M,大腦為ODC,這些基因適合在相應(yīng)組織中做單一內(nèi)參基因。Genorm分析,所有Vn/Vn+1都小于0.15,說(shuō)明2個(gè)最穩(wěn)定內(nèi)參基因足以滿足在相應(yīng)條件下的定量校正。3.4種基因在各組織中均可檢測(cè)到,除TNF-a外且具有組織特異性。Defensin皮膚中表達(dá)量顯著高于其他組織(P0.05)；Hepcidin在肝臟中表達(dá)最高,其次為脾臟和后腸,不同組織間差異顯著(P0.曬)；IL-10在腮中表達(dá)顯著高于其他各組織(P0.05),其次為脾臟、后腸、頭腎等組織；TNF-a在各組織中表達(dá)差異不顯著(P0.05)�？傮w表達(dá)量來(lái)看,IL-10和TNF-a在各組織中表達(dá)水平相對(duì)較低。4.隨著日糧蛋白水平提高,Defensin在大腦、IL-10在腮和后腸表達(dá)模式相同,表達(dá)水平均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),最高表達(dá)都出現(xiàn)在Ⅱ組,顯著高于其他各組(P0.05),2種基因在其余組織各組間表達(dá)差異不顯著(P＞0.05)；Hepcdin在大腦、肝臟和脾臟中表達(dá)量先增加后降低,均在Ⅲ組達(dá)到最高,其余組織各組間表達(dá)差異不顯著(P0.05)；TNF-a基因除了心臟中有先升高后下降趨勢(shì)外,其他各組織組間差異不顯著(P0.05)。研究結(jié)果提示,檢測(cè)各組不同組織4種基因表達(dá)時(shí),可考慮EF-1a作單一內(nèi)參基因；檢測(cè)4種基因在同一組織中表達(dá)分析時(shí),應(yīng)選用相應(yīng)的適宜內(nèi)參基因,肝臟和皮膚可選EF-1α,后腸、脾臟、腮、心臟和頭腎可選B2M,腦可選ODC。日糧中適宜的蛋白添加水平可以促進(jìn)相關(guān)免疫基因的表達(dá),當(dāng)添加蛋白量為40.10%時(shí),Defensin和IL-10基因組織表達(dá)量最高,生長(zhǎng)性能最好,添加蛋白量為44.34%時(shí),Hepcdin基因表達(dá)最好,若均衡免疫調(diào)控,鱸鯉日糧適宜蛋白質(zhì)水平為40.10%～4.34%。
【關(guān)鍵詞】：鱸鯉 蛋白水平 免疫基因 內(nèi)參基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 綜述10-19
• 1.1 鱸鯉的基本概況10-12
• 1.1.1 鱸鯉的生物學(xué)特性10
• 1.1.2 鱸鯉養(yǎng)殖現(xiàn)狀10-12
• 1.2 蛋白質(zhì)對(duì)魚類免疫力的影響12-14
• 1.2.1 日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)魚類免疫力影響12-13
• 1.2.2 日糧氨基酸和多肽水平對(duì)魚類免疫力影響13-14
• 1.3 Defensin、Hepcidin、TNF-α和IL-10基因研究進(jìn)展14-18
• 1.3.1 Defensin基因研究進(jìn)展15-16
• 1.3.2 Hepcidin基因研究進(jìn)展16
• 1.3.3 TNF-α基因研究進(jìn)展16-17
• 1.3.4 IL-10基因研究進(jìn)展17-18
• 1.4 內(nèi)參基因18
• 1.5 選題依據(jù)和意義18-19
• 2 材料與方法19-27
• 2.1 試驗(yàn)日糧19-20
• 2.2 試驗(yàn)條件及管理20-21
• 2.3 主要儀器設(shè)備21-22
• 2.4 試驗(yàn)試劑22
• 2.5 常用試劑的配制22
• 2.6 試驗(yàn)方法22-26
• 2.6.1 總RNA提取22-23
• 2.6.2 TotalRNA的質(zhì)檢23
• 2.6.3 cDNA合成23-24
• 2.6.4 PCR引物設(shè)計(jì)24
• 2.6.5 PCR擴(kuò)增和測(cè)序24-25
• 2.6.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR25-26
• 2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析26-27
• 3 結(jié)果與分析27-44
• 3.1 鱸鯉Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因PCR擴(kuò)增結(jié)果27-28
• 3.2 鱸鯉Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因ORF及其氨基酸序列分析28-29
• 3.3 鱸鯉Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10氨基酸進(jìn)化分析29
• 3.4 鱸鯉Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因編碼蛋白的理化性質(zhì)29-33
• 3.5 內(nèi)參基因評(píng)定與篩選33-39
• 3.5.1 不同蛋白水平下鱸鯉各組織中內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析35-37
• 3.5.2 適宜內(nèi)參基因確定37-39
• 3.6 不同蛋白水平日糧對(duì)鱸鯉Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因組織表達(dá)39-44
• 4 討論44-48
• 4.1 鱸鯉Hepcidin、Defensin、IL-10和TNF-α基因序列分析44-45
• 4.2 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析45-46
• 4.3 鱸鯉Hepcidin、Defensin、IL-10和TNF-α基因表達(dá)分析46-48
• 5 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-58
• 致謝58-59
• 附錄59-65
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況65

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