發(fā)布時(shí)間：2017-10-04 06:05

  本文關(guān)鍵詞：長(zhǎng)春花轉(zhuǎn)錄組與萜類吲哚生物堿代謝途徑研究

  更多相關(guān)文章： 長(zhǎng)春花 轉(zhuǎn)錄組 高通量測(cè)序 萜類吲哚生物堿 環(huán)烯醚萜途徑

【摘要】：長(zhǎng)春花是抗腫瘤藥物長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿的唯一植物來(lái)源,也是研究萜類吲哚生物堿(TIA)生物合成與調(diào)控的模式物種。本研究分別利用Illumina二代測(cè)序技術(shù)和PacBio三代測(cè)序技術(shù)對(duì)長(zhǎng)春花的葉、花和根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序和分析。通過(guò)Illumina測(cè)序共得到140,787,121條短reads,經(jīng)de novo拼接獲得191,167條inigenes,平均長(zhǎng)度674bp。基因注釋發(fā)現(xiàn)了許多參與不同生物學(xué)過(guò)程和具有不同功能的基因,56.12%的基因在與7大數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)中顯示出同源性。GO分類鑒定出261個(gè)與次生代謝有關(guān)的基因,KOG分類鑒定出1809個(gè)與次生代謝合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解有關(guān)的基因,KEGG注釋鑒定出604個(gè)與萜類合成有關(guān)的基因及12個(gè)與吲哚生物堿合成有關(guān)的基因。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示,大多數(shù)TIAs途徑相關(guān)基因在根和葉中的表達(dá)量較高,而文多靈途徑的特有基因則在地上部分具有較高的表達(dá)量。因此,根據(jù)與已知基因的共表達(dá)原理,篩選出可能參與TIAs生物合成的8個(gè)P450候選基因和5個(gè)功能基因。三代測(cè)序共獲得786,008條長(zhǎng)reads,其中花264,553條、根262,140條、葉259,315條。經(jīng)數(shù)據(jù)處理,得到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本(full-length reads) 378,581條(花：123,665條、根：120,510條、葉：134,406條),非全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本(non-full-length reads)311,081條(花：105,613條、根：106,459條、葉：99,009條)。通過(guò)比對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列,分析轉(zhuǎn)錄因子及已知的長(zhǎng)春花TIAs途徑催化酶編碼基因,發(fā)現(xiàn)了一些可能的可變剪切形式,提示可變剪切可能參與TIAs生物合成途徑的調(diào)控。采用不同平臺(tái)進(jìn)行的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)檠芯块L(zhǎng)春花特殊的次生代謝產(chǎn)物合成途徑提供了豐富的數(shù)據(jù)資源,PacBio三代測(cè)序技術(shù)在讀長(zhǎng)上的優(yōu)勢(shì)也使得分析可變剪切及探究可變剪切對(duì)TIAs途徑相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響成為了可能。本研究還初步探索了通過(guò)在釀酒母中重構(gòu)TIAs合成途徑生產(chǎn)TIAs的可行性。首先通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母稀有密碼子在長(zhǎng)春花基因中的使用頻率偏低,推測(cè)長(zhǎng)春花基因適合在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)。克隆了10個(gè)已知的環(huán)烯醚萜途徑催化酶基因,經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),除CPR、DLGT、IRS 和 LAMT存在個(gè)別堿基的差異外,其余序列均與GenBank序列完全一致。采用SOE-PCR法構(gòu)建催化環(huán)烯醚萜途徑前兩步反應(yīng)的GES、G10H 和 CPR表達(dá)模塊,通過(guò)酵母體內(nèi)重組方法構(gòu)建三元表達(dá)載體,建立從元件選擇、模塊構(gòu)建到多模塊體內(nèi)重組的技術(shù)流程,為實(shí)現(xiàn)完整TIAs合成途徑在酵母中的重建奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：長(zhǎng)春花 轉(zhuǎn)錄組 高通量測(cè)序 萜類吲哚生物堿 環(huán)烯醚萜途徑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S567.19;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第一章 前言9-27
• 1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)及研究進(jìn)展9-14
• 1.1.1 測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展9-13
• 1.1.2 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究進(jìn)展13-14
• 1.2 長(zhǎng)春花轉(zhuǎn)錄組與萜類吲哚生物堿代謝途徑研究進(jìn)展14-25
• 1.2.1 長(zhǎng)春花轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展15-16
• 1.2.2 長(zhǎng)春花萜類吲哚生物堿代謝途徑的解析16-22
• 1.2.3 長(zhǎng)春花萜類吲哚生物堿代謝途徑的調(diào)控22-25
• 1.3 合成生物學(xué)與天然產(chǎn)物的異源合成25-27
• 1.3.1 合成生物學(xué)的概念與研究思路25-26
• 1.3.2 合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物異源合成研究中的應(yīng)用26-27
• 第二章 研究材料與方法27-44
• 2.1 材料、試劑與設(shè)備27-29
• 2.1.1 植物材料27
• 2.1.2 試劑27-28
• 2.1.2.1 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和均一化27
• 2.1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序27
• 2.1.2.3 PCR、電泳和載體構(gòu)建27-28
• 2.1.3 主要設(shè)備28-29
• 2.1.3.1 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和均一化28
• 2.1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序28
• 2.1.3.3 PCR、電泳和載體構(gòu)建28-29
• 2.2 方法29-44
• 2.2.1 PacBio三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序29-39
• 2.2.1.1 總RNA的提取29
• 2.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄與cDNA均一化29-37
• 2.2.1.3 片段分選37-38
• 2.2.1.4 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序38-39
• 2.2.1.5 數(shù)據(jù)處理與分析39
• 2.2.2 Illumina二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序39-40
• 2.2.2.1 總RNA的提取39
• 2.2.2.2 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序39
• 2.2.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析39-40
• 2.2.3 代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與載體構(gòu)建40-44
• 2.2.3.1 基因克隆40-42
• 2.2.3.2 載體構(gòu)建42-44
• 第三章 結(jié)果與討論44-72
• 3.1 基于Illumina二代測(cè)序平臺(tái)的長(zhǎng)春花轉(zhuǎn)錄組分析44-57
• 3.1.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估與預(yù)處理44-45
• 3.1.2 轉(zhuǎn)錄本拼接45-46
• 3.1.3 基因功能注釋46-50
• 3.1.4 SSR分析50-51
• 3.1.5 差異表達(dá)分析51-55
• 3.1.6 TIAs途徑基因表達(dá)差異分析及基因挖掘55-57
• 3.2 基于PacBio三代測(cè)序平臺(tái)的可變剪切分析57-60
• 3.2.1 PacBio三代測(cè)序與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本57-59
• 3.2.2 TIAs合成途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及催化酶編碼基因的可變剪切59-60
• 3.3 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的密碼子使用偏好性分析60-64
• 3.3.1 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行密碼子使用偏好性分析的可行性60-61
• 3.3.2 基于轉(zhuǎn)錄組的長(zhǎng)春花密碼子偏好性分析61-64
• 3.3.2.1 長(zhǎng)春花基因密碼子的GC含量分析61
• 3.3.2.2 長(zhǎng)春花基因有效密碼子數(shù)(ENC)分析61-62
• 3.3.2.3 長(zhǎng)春花基因最優(yōu)密碼子分析62-64
• 3.4 環(huán)烯醚萜的途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與載體構(gòu)建64-72
• 3.4.1 環(huán)烯醚萜途徑關(guān)鍵酶基因的克隆64-67
• 3.4.2 SOE-PCR法構(gòu)建表達(dá)模塊67-72
• 第四章 結(jié)論72-73
• 參考文獻(xiàn)73-87
• 縮略詞87-88
• 附錄88-108
• 致謝108-109
• 作者簡(jiǎn)歷109

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 朱孝軒;朱英杰;宋經(jīng)元;孫超;陳士林;;基于全基因組和轉(zhuǎn)錄組分析的赤芝密碼子使用偏好性比較研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2014年09期

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本文編號(hào)：969008