本文關(guān)鍵詞：刺參體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與抗?fàn)N爛弧菌感染相關(guān)免疫基因的篩選及表達(dá)研究

  更多相關(guān)文章： 刺參(Apostichopus japonicus) 燦爛弧菌 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 熒光定量PCR

【摘要】：刺參(Apostichopus japonicus)是目前我國(guó)養(yǎng)殖面積較廣的品種,具有極高的食用和藥用價(jià)值,也是我國(guó)目前海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的種類。但是隨著人工養(yǎng)殖的深入開(kāi)展,出現(xiàn)了一系列的問(wèn)題,如病害頻發(fā)和種質(zhì)退化,很大程度地制約了刺參養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。本文以刺參為研究對(duì)象,利用新一代測(cè)序技術(shù)構(gòu)建刺參的基因表達(dá)譜,通過(guò)對(duì)表達(dá)譜進(jìn)行分析獲得差異表達(dá)基因,從中篩選潛在的免疫相關(guān)基因,并利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)初步驗(yàn)證免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況。主要結(jié)果如下：對(duì)來(lái)自同一家系的刺參進(jìn)行人工攻毒感染實(shí)驗(yàn),可得抗病組(A)、易感組(S)、空白對(duì)照組(K)及陰性對(duì)照組(C)。提取四組的體腔液RNA,并對(duì)其RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基因表達(dá)譜分析。通過(guò)Illumina測(cè)序平臺(tái),得到320106172個(gè)原始reads,經(jīng)過(guò)去除帶接頭(adaptor)、低質(zhì)量(質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個(gè)read的20以上)及比例大于5%的N(N表示無(wú)法確定堿基信息)堿基的reads后得到319455942 clean reads。通過(guò)軟件的拼接組裝得到186658個(gè)轉(zhuǎn)錄本和89891個(gè)unigene。這些unigene被分布到GO的三個(gè)子類別中—生物過(guò)程(9574)、細(xì)胞組成(11078)和分子功能(10994)。18887個(gè)unigene被注釋到KEGG中,有2972個(gè)基因有酶活編號(hào),4005個(gè)基因參與代謝通路。13126個(gè)基因分布到25個(gè)KOG類別中。另外,通過(guò)比較抗病組和對(duì)照組、創(chuàng)傷組的表達(dá)譜,得到358個(gè)差異顯著基因,其中13個(gè)上調(diào)基因和345個(gè)下調(diào)基因；同理,通過(guò)比較易感組與對(duì)照組、創(chuàng)傷組,得到102個(gè)差異顯著基因,有86個(gè)上調(diào)基因和16個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)參考免疫信號(hào)通路及GO、KEGG、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道,可得到30個(gè)潛在的抗病基因及19個(gè)易感基因。對(duì)上面篩選得到的抗病基因和易感基因進(jìn)行RT-PCR引物設(shè)計(jì),分別設(shè)計(jì)出24對(duì)抗病基因引物和15對(duì)易感基因引物,對(duì)這些基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建以及相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè),結(jié)果顯示每個(gè)基因引物的擴(kuò)增效果良好。對(duì)隨機(jī)編號(hào)的A1-A20基因和S1-S5基因均構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線,擴(kuò)增效率為0.92-1.11,相關(guān)系數(shù)為0.990-0.999。相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果表明：A8的表達(dá)量上調(diào),與測(cè)序結(jié)果不符,而其他基因的相對(duì)表達(dá)量基本與測(cè)序結(jié)果一致。在本研究中,重新隨機(jī)抓取一批另一家系的刺參,重新進(jìn)行人工攻毒感染實(shí)驗(yàn),進(jìn)行RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,將其作為模板,對(duì)前面篩選的基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè),結(jié)果表明：除基因S17外,其他基因的相對(duì)表達(dá)量與測(cè)序結(jié)果一致。此外,一些基因可以參與免疫信號(hào)通路,主要有5個(gè)信號(hào)通路,包括溶酶體(Lysosome)、內(nèi)吞作用(Endocytosis)、趨化因子(Chemokine signaling pathway)、絲分裂原蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)和表皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(ERBB signaling pathway)。其中SGSH、DNaseⅡ、ABCA2、AP-3、NEU1和AP-1參與溶酶體作用,RTK、AP-2、PAR6、rabaptin5、CHMP5、VPS37參與內(nèi)吞作用,JNK、MEKK4、FLNA、NFkB、EGFR參與MAPK信號(hào)通路,JNK、NCK、STAT5、ERBB-1參與ERBB信號(hào)通路,FOXO、AC(包含2個(gè)基因)、STAT5、 NFkB參與趨化因子信號(hào)通路。
【關(guān)鍵詞】：刺參(Apostichopus japonicus) 燦爛弧菌 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S947.9
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 引言11-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1. 養(yǎng)殖刺參病原的研究概況13-15
• 2. 刺參體腔液防御機(jī)制的研究進(jìn)展15-16
• 3. 刺參免疫相關(guān)基因的研究進(jìn)展16-17
• 4. 基因表達(dá)譜17-18
• 5. 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展18-19
• 6. 免疫信號(hào)通路的研究19-20
• 7. 研究目的及意義20-22
• 第二章 刺參體腔液細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序22-42
• 1. 材料與方法22-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析27-40
• 2.1 刺參攻毒感染結(jié)果27
• 2.2 總RNA提取及文庫(kù)構(gòu)建27-30
• 2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理30-31
• 2.4 數(shù)據(jù)拼接組裝31-32
• 2.5 基因注釋32-34
• 2.6 生物信息學(xué)分析34-38
• 2.7 SSR、SNP的檢測(cè)38-40
• 3 討論40-42
• 第三章 不同抗病力刺參體腔液基因的表達(dá)譜構(gòu)建及抗刺參燦爛弧菌免疫相關(guān)基因篩選42-61
• 1. 材料與方法42-44
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-57
• 2.1 刺參潛在的抗?fàn)N爛弧菌相關(guān)免疫基因的表達(dá)譜構(gòu)建44-50
• 2.2 刺參抗?fàn)N爛弧菌相關(guān)免疫基因的篩選50
• 2.3 刺參的免疫代謝通路50-57
• 3. 討論57-61
• 第四章 刺參抗?fàn)N爛弧菌相關(guān)免疫基因的驗(yàn)證與表達(dá)研究61-97
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料和方法61-64
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料61-62
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法62-64
• 2. 結(jié)果64-94
• 2.1 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果64
• 2.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄64-65
• 2.3 cDNA合成結(jié)果65
• 2.4 引物設(shè)計(jì)65-66
• 2.5 熒光定量PCR條件優(yōu)化66-67
• 2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立67-74
• 2.7 候選基因在不同實(shí)驗(yàn)組之間的差異情況74-82
• 2.8 實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的比較82
• 2.9 基因表達(dá)研究結(jié)果82-93
• 2.10 實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的比較93-94
• 3. 討論94-97
• 總結(jié)97-99
• 參考文獻(xiàn)99-113
• 致謝113-114
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷114-115
• 學(xué)術(shù)成果115-116
• 附表116-127

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 常忠岳;影響刺參生長(zhǎng)及成活因素的探討[J];漁業(yè)致富指南;2003年08期

2 李華琳,李文姬;刺參池塘健康養(yǎng)殖[J];河北漁業(yè);2005年03期

3 朱偉,麥康森,張百剛,王福振,徐桂玉;刺參稚參對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪需求量的初步研究[J];海洋科學(xué);2005年03期

4 王春忠;;南方沿海地區(qū)池塘吊養(yǎng)刺參試驗(yàn)[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2006年06期

5 王春忠;;刺參的池塘吊養(yǎng)試驗(yàn)[J];水產(chǎn)科技情報(bào);2007年01期

6 王穎;仇雪梅;王娟;王秀利;;刺參病害現(xiàn)狀及其生物技術(shù)檢測(cè)的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2009年11期

7 李彬斌;朱偉;馮政夫;李玲;胡彥江;;飼料中磷脂含量對(duì)刺參生長(zhǎng)和體成分的影響[J];海洋科學(xué);2009年09期

8 張安國(guó);;刺參疾病學(xué)研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年35期

9 閔建;亢勇軍;;南黃海高涂池塘養(yǎng)殖刺參適應(yīng)性研究[J];中國(guó)水產(chǎn);2011年02期

10 閔建;亢勇軍;;南黃海高涂池塘養(yǎng)殖刺參適應(yīng)性研究試驗(yàn)[J];現(xiàn)代漁業(yè)信息;2011年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 徐文其;沈建;王超群;周榮;;刺參機(jī)械去臟工藝的實(shí)驗(yàn)研究[A];中國(guó)工程院第77場(chǎng)工程科技論壇·2008水產(chǎn)科技論壇——漁業(yè)現(xiàn)代化與可持續(xù)發(fā)展論文集[C];2008年

2 林琪;何麗斌;葛輝;方旅平;周宸;;度夏養(yǎng)殖刺參弧菌病的研究[A];2012年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2012年

3 姜素芬;吉愛(ài)國(guó);宋淑亮;梁浩;朱鵬;;鮮刺參多糖的提取及分離純化[A];中國(guó)資源生物技術(shù)與糖工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

4 孫永欣;李樹(shù)英;溫志新;盧舜堯;;免疫柞蠶蛹粉對(duì)海參(刺參)生長(zhǎng)、免疫力、腸道菌群和腸道形態(tài)的影響[A];全國(guó)家(柞)蠶資源高值化利用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

5 王興章;邢信澤;;刺參在我國(guó)北方增養(yǎng)殖發(fā)展現(xiàn)狀及技術(shù)探討[A];山東省科協(xié)重點(diǎn)學(xué)術(shù)研討活動(dòng)成果——山東生態(tài)省建設(shè)與發(fā)展論文匯編[C];2004年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 劉國(guó)信;刺參的采集與加工[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2006年

2 高國(guó)懷 高金誠(chéng);海參知識(shí)（一）[N];中國(guó)漁業(yè)報(bào);2005年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 潘洋;刺參運(yùn)動(dòng)節(jié)律行為的數(shù)量化研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所);2015年

2 于海波;飼料中添加玉米和豆粕對(duì)刺參消化生理和免疫學(xué)的影響[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

3 譚杰;刺參(Apostichopus japonicus)苗種繁育關(guān)鍵技術(shù)及幼參對(duì)操作脅迫的免疫應(yīng)答研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

4 劉石林;刺參耐高溫品系選育及其性狀評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

5 邢坤;刺參生態(tài)增養(yǎng)殖原理與關(guān)鍵技術(shù)[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2009年

6 張琴;刺參（Apostichopus japonicus Selenka）高效免疫增強(qiáng)劑的篩選與應(yīng)用[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

7 梁淼;刺參（Apostichopus japonicus）個(gè)體生長(zhǎng)差異的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

8 劉營(yíng);不同飼料對(duì)刺參（Apostichopus japonicus）生長(zhǎng)及能量收支的影響及機(jī)制[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

9 金波昌;池塘養(yǎng)殖刺參（Apostichopus japonicus）食物來(lái)源的穩(wěn)定同位素法研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

10 李繼業(yè);養(yǎng)殖刺參免疫學(xué)特征與病害研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2007年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王世英;微生物發(fā)酵飼料在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用[D];集美大學(xué);2015年

2 詹春蘭;刺參絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的克隆、表達(dá)及性質(zhì)分析[D];集美大學(xué);2015年

3 王歡;刺參多肽影響NIH/3T3細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的研究[D];山東大學(xué);2015年

4 高岳;不同產(chǎn)地刺參多糖的分離純化及其組分含量的研究[D];大連海洋大學(xué);2015年

5 秦搏;滸苔和纖維素酶在刺參飼料中的應(yīng)用研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

6 張宏曄;海州灣前三島海域底播刺參群體生態(tài)分布特征及其食性分析[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所);2015年

7 劉師岐;刺參Serpin基因的克隆、原核表達(dá)及其在自溶過(guò)程中的變化研究[D];大連工業(yè)大學(xué);2015年

8 郭航;海藻酸降解菌的篩選及其在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用[D];大連工業(yè)大學(xué);2015年

9 白陽(yáng);殼聚糖和殼寡糖及其配合物對(duì)刺參生長(zhǎng)和品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的影響[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

10 高瓊;刺參體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與抗?fàn)N爛弧菌感染相關(guān)免疫基因的篩選及表達(dá)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：935182