發(fā)布時(shí)間：2017-09-18 18:34

  本文關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5a功能的研究

  更多相關(guān)文章： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 ORF5a 感染性克隆 5aM細(xì)胞系 功能性研究

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于RNA病毒中的單股正鏈RNA病毒,該病毒與馬動(dòng)脈炎病毒(equine arteritis virus,EAV)、猴出血熱病毒(simian hemorrhagic fever virus,SHFV)和小鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)同屬于動(dòng)脈炎病毒屬。PRRS V根據(jù)其基因型分為I型(歐洲)和II型(美洲),而國(guó)內(nèi)的流行毒株主要為II型PRRSV。最新研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)普遍存在于動(dòng)脈炎病毒屬的開放性閱讀框—ORF5a,利用反向遺傳操作系統(tǒng)對(duì)ORF5a的重要性進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其對(duì)EAV起重要作用,并對(duì)PRRSV的存活是必需的。但是ORF5a是以何種方式起作用,具體的功能是什么尚不明確,有待進(jìn)一步的研究。本研究利用反向遺傳操作技術(shù),對(duì)ORF5a的功能做進(jìn)一步的探討,為PRRSV的基礎(chǔ)性研究奠定基礎(chǔ)。本研究在實(shí)驗(yàn)室已有的PRRSV的感染性克隆質(zhì)粒p Hu N4-F112上進(jìn)行改造,將ORF5a的起始密碼子ATG突變?yōu)镚TG,構(gòu)建了ORF5a失活的感染性克隆質(zhì)粒p Hu N4-F112-Δ5a,體外轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后在MARC-145細(xì)胞上拯救病毒。結(jié)果表明,拯救毒株在MARC-145細(xì)胞上傳代的第一代可以檢測(cè)到PRRSV的基因組,但是檢測(cè)不到病毒蛋白,證明ORF5a的存在是PRRSV存活所必需,并推測(cè)ORF5a可能參與病毒蛋白的合成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ORF5a的功能,將ORF5a插入慢病毒表達(dá)載體(p WPXL)中與輔助質(zhì)粒(p SPAX2、p MD2.G)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收獲重組病毒,將病毒液上清純化后感染MARC-145細(xì)胞,篩選得到穩(wěn)定表達(dá)ORF5a細(xì)胞系,命名為5a M細(xì)胞系。將p Hu N4-F112-Δ5a在構(gòu)建的5a M細(xì)胞系上拯救,得到復(fù)制缺陷型病毒,說明ORF5a蛋白的穩(wěn)定表達(dá)可以補(bǔ)償突變株p Hu N4-F112-Δ5a合成病毒粒子蛋白的功能,因而推測(cè)ORF5a可能參與病毒的蛋白翻譯過程。將拯救出的病毒繼續(xù)在5a M細(xì)胞系上傳3代,得到具有感染性的病毒,對(duì)其各代基因組進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)p Hu N4-F112-Δ5a的突變位點(diǎn)發(fā)生回復(fù)突變—GTG重新變回ATG。另外,當(dāng)p Hu N4-F112-Δ5a在MARC-145非凍融連續(xù)傳代,其基因組會(huì)持續(xù)存在,但ORF5a的突變位點(diǎn)不能回復(fù)突變,說明5a M細(xì)胞系中ORF5a的補(bǔ)償可以使突變株p Hu N4-F112-Δ5a的缺陷基因組回復(fù)突變形成了具有感染性的病毒粒子。綜上所述,ORF5a蛋白失活導(dǎo)致病毒粒子蛋白不能合成,因而對(duì)PRRSV的存活是必需的,另外ORF5a的穩(wěn)定表達(dá)使突變株p Hu N4-F112-Δ5a的突變位點(diǎn)GTG回復(fù)為ATG。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 ORF5a 感染性克隆 5aM細(xì)胞系 功能性研究
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 PRRSV的生物學(xué)特征13-17
• 1.1.1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)以及亞基因的組成13-15
• 1.1.2 PRRSV主要的結(jié)構(gòu)蛋白15-16
• 1.1.3 PRRSV的病毒侵入16-17
• 1.2 ORF5A的研究進(jìn)展17-19
• 1.2.1 ORF5A的發(fā)現(xiàn)18
• 1.2.2 EAV中ORF5A的重要性18
• 1.2.3 PRRSV 中 PRF5a 的必需性18-19
• 1.3 反向遺傳操作技術(shù)在動(dòng)脈炎病毒屬中的應(yīng)用現(xiàn)狀19-20
• 1.4 研究的目的和意義20-21
• 第二章 PRRSV ORF5A突變株的構(gòu)建及生物學(xué)分析21-31
• 2.1 材料21
• 2.1.1 毒株、菌株、細(xì)胞21
• 2.1.2 主要試劑與儀器21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 ORF5A相對(duì)位置分析21-22
• 2.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成22
• 2.2.3 定點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建22-24
• 2.2.4 病毒的拯救24-25
• 2.2.5 拯救病毒感染性克隆缺失株RHUN4-F112-Δ5A鑒定及生物學(xué)分析25-27
• 2.3 結(jié)果27-29
• 2.3.1 拯救病毒PT-PCR檢測(cè)結(jié)果27-28
• 2.3.2 拯救病毒突變位點(diǎn)鑒定結(jié)果28
• 2.3.3 拯救病毒蛋白檢測(cè)結(jié)果28
• 2.3.4 拯救病毒病變觀察的結(jié)果28-29
• 2.4 討論29-30
• 2.5 小結(jié)30-31
• 第三章 PRRSV ORF5A細(xì)胞系的建立31-39
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料31
• 3.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、菌株31
• 3.1.2 主要的試劑及儀器31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-36
• 3.2.1 目的片段表達(dá)載體的構(gòu)建31-34
• 3.2.2 含有目的片段的MARC-145細(xì)胞系的建立34-35
• 3.2.3 含有目的片段的MARC-145細(xì)胞系的鑒定35-36
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-38
• 3.3.1 表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果36
• 3.3.2 構(gòu)建質(zhì)粒過程中的鑒定結(jié)果36-37
• 3.3.3 重組質(zhì)粒 5A-PWPXL的鑒定結(jié)果37
• 3.3.4 細(xì)胞系的熒光結(jié)果37
• 3.3.5 細(xì)胞系的GFP蛋白的檢測(cè)結(jié)果37-38
• 3.4 討論38-39
• 第四章 缺陷株在 5AM細(xì)胞系上拯救及生物學(xué)分析39-48
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料39
• 4.1.1 細(xì)胞39
• 4.1.2 主要試劑及儀器39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 4.2.1 補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)39-40
• 4.2.2 缺陷株在MARC-145細(xì)胞上的拯救及非凍融傳代40-41
• 4.2.3 缺失株在 ORF5a 的 MARC-145 細(xì)胞系上拯救的鑒定及生物學(xué)特性分析41
• 4.2.4 ORF5a 蛋白免疫原性檢測(cè)41-42
• 4.3 結(jié)果42-45
• 4.3.1 基因組的檢測(cè)結(jié)果42-43
• 4.3.2 突變位點(diǎn)的鑒定43
• 4.3.3 細(xì)胞病變的觀察43-44
• 4.3.4 細(xì)胞病變的觀察44
• 4.3.5 ORF5a 蛋白的免疫原性鑒定結(jié)果44-45
• 4.4 討論45-46
• 4.5 小結(jié)46-48
• 第五章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 致謝55-56
• 作者簡(jiǎn)歷56

【相似文獻(xiàn)】

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