本文關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5a功能的研究

  更多相關(guān)文章： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 ORF5a 感染性克隆 5aM細胞系 功能性研究

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于RNA病毒中的單股正鏈RNA病毒,該病毒與馬動脈炎病毒(equine arteritis virus,EAV)、猴出血熱病毒(simian hemorrhagic fever virus,SHFV)和小鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)同屬于動脈炎病毒屬。PRRS V根據(jù)其基因型分為I型(歐洲)和II型(美洲),而國內(nèi)的流行毒株主要為II型PRRSV。最新研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)一個普遍存在于動脈炎病毒屬的開放性閱讀框—ORF5a,利用反向遺傳操作系統(tǒng)對ORF5a的重要性進行驗證,發(fā)現(xiàn)其對EAV起重要作用,并對PRRSV的存活是必需的。但是ORF5a是以何種方式起作用,具體的功能是什么尚不明確,有待進一步的研究。本研究利用反向遺傳操作技術(shù),對ORF5a的功能做進一步的探討,為PRRSV的基礎(chǔ)性研究奠定基礎(chǔ)。本研究在實驗室已有的PRRSV的感染性克隆質(zhì)粒p Hu N4-F112上進行改造,將ORF5a的起始密碼子ATG突變?yōu)镚TG,構(gòu)建了ORF5a失活的感染性克隆質(zhì)粒p Hu N4-F112-Δ5a,體外轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后在MARC-145細胞上拯救病毒。結(jié)果表明,拯救毒株在MARC-145細胞上傳代的第一代可以檢測到PRRSV的基因組,但是檢測不到病毒蛋白,證明ORF5a的存在是PRRSV存活所必需,并推測ORF5a可能參與病毒蛋白的合成。為了進一步驗證ORF5a的功能,將ORF5a插入慢病毒表達載體(p WPXL)中與輔助質(zhì)粒(p SPAX2、p MD2.G)共轉(zhuǎn)染293T細胞,收獲重組病毒,將病毒液上清純化后感染MARC-145細胞,篩選得到穩(wěn)定表達ORF5a細胞系,命名為5a M細胞系。將p Hu N4-F112-Δ5a在構(gòu)建的5a M細胞系上拯救,得到復制缺陷型病毒,說明ORF5a蛋白的穩(wěn)定表達可以補償突變株p Hu N4-F112-Δ5a合成病毒粒子蛋白的功能,因而推測ORF5a可能參與病毒的蛋白翻譯過程。將拯救出的病毒繼續(xù)在5a M細胞系上傳3代,得到具有感染性的病毒,對其各代基因組進行測序,發(fā)現(xiàn)p Hu N4-F112-Δ5a的突變位點發(fā)生回復突變—GTG重新變回ATG。另外,當p Hu N4-F112-Δ5a在MARC-145非凍融連續(xù)傳代,其基因組會持續(xù)存在,但ORF5a的突變位點不能回復突變,說明5a M細胞系中ORF5a的補償可以使突變株p Hu N4-F112-Δ5a的缺陷基因組回復突變形成了具有感染性的病毒粒子。綜上所述,ORF5a蛋白失活導致病毒粒子蛋白不能合成,因而對PRRSV的存活是必需的,另外ORF5a的穩(wěn)定表達使突變株p Hu N4-F112-Δ5a的突變位點GTG回復為ATG。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 ORF5a 感染性克隆 5aM細胞系 功能性研究
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 PRRSV的生物學特征13-17
• 1.1.1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)以及亞基因的組成13-15
• 1.1.2 PRRSV主要的結(jié)構(gòu)蛋白15-16
• 1.1.3 PRRSV的病毒侵入16-17
• 1.2 ORF5A的研究進展17-19
• 1.2.1 ORF5A的發(fā)現(xiàn)18
• 1.2.2 EAV中ORF5A的重要性18
• 1.2.3 PRRSV 中 PRF5a 的必需性18-19
• 1.3 反向遺傳操作技術(shù)在動脈炎病毒屬中的應(yīng)用現(xiàn)狀19-20
• 1.4 研究的目的和意義20-21
• 第二章 PRRSV ORF5A突變株的構(gòu)建及生物學分析21-31
• 2.1 材料21
• 2.1.1 毒株、菌株、細胞21
• 2.1.2 主要試劑與儀器21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 ORF5A相對位置分析21-22
• 2.2.2 引物設(shè)計及合成22
• 2.2.3 定點突變質(zhì)粒的構(gòu)建22-24
• 2.2.4 病毒的拯救24-25
• 2.2.5 拯救病毒感染性克隆缺失株RHUN4-F112-Δ5A鑒定及生物學分析25-27
• 2.3 結(jié)果27-29
• 2.3.1 拯救病毒PT-PCR檢測結(jié)果27-28
• 2.3.2 拯救病毒突變位點鑒定結(jié)果28
• 2.3.3 拯救病毒蛋白檢測結(jié)果28
• 2.3.4 拯救病毒病變觀察的結(jié)果28-29
• 2.4 討論29-30
• 2.5 小結(jié)30-31
• 第三章 PRRSV ORF5A細胞系的建立31-39
• 3.1 實驗材料31
• 3.1.1 細胞、質(zhì)粒、菌株31
• 3.1.2 主要的試劑及儀器31
• 3.2 實驗方法31-36
• 3.2.1 目的片段表達載體的構(gòu)建31-34
• 3.2.2 含有目的片段的MARC-145細胞系的建立34-35
• 3.2.3 含有目的片段的MARC-145細胞系的鑒定35-36
• 3.3 實驗結(jié)果36-38
• 3.3.1 表達載體與輔助質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果36
• 3.3.2 構(gòu)建質(zhì)粒過程中的鑒定結(jié)果36-37
• 3.3.3 重組質(zhì)粒 5A-PWPXL的鑒定結(jié)果37
• 3.3.4 細胞系的熒光結(jié)果37
• 3.3.5 細胞系的GFP蛋白的檢測結(jié)果37-38
• 3.4 討論38-39
• 第四章 缺陷株在 5AM細胞系上拯救及生物學分析39-48
• 4.1 實驗材料39
• 4.1.1 細胞39
• 4.1.2 主要試劑及儀器39
• 4.2 實驗方法39-42
• 4.2.1 補償實驗39-40
• 4.2.2 缺陷株在MARC-145細胞上的拯救及非凍融傳代40-41
• 4.2.3 缺失株在 ORF5a 的 MARC-145 細胞系上拯救的鑒定及生物學特性分析41
• 4.2.4 ORF5a 蛋白免疫原性檢測41-42
• 4.3 結(jié)果42-45
• 4.3.1 基因組的檢測結(jié)果42-43
• 4.3.2 突變位點的鑒定43
• 4.3.3 細胞病變的觀察43-44
• 4.3.4 細胞病變的觀察44
• 4.3.5 ORF5a 蛋白的免疫原性鑒定結(jié)果44-45
• 4.4 討論45-46
• 4.5 小結(jié)46-48
• 第五章 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-55
• 致謝55-56
• 作者簡歷56

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 游志勇;;對病毒的再認識[J];醫(yī)學與哲學;1988年01期

2 ;病毒“抱團”侵襲機體效率高[J];中華中醫(yī)藥學刊;2010年03期

3 丁鏟;;病毒的進化與傳播[J];中國動物傳染病學報;2010年04期

4 顧葆良;;病毒基因及其應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1981年02期

5 馬亞敏;;病毒基因能夠保護植物免遭病害[J];生物技術(shù)通報;1986年05期

6 Andrew Scott;史久華;;改善病毒的印象[J];世界科學;1989年09期

7 向近敏;;關(guān)于病毒生態(tài)的幾個問題[J];中國微生態(tài)學雜志;1990年01期

8 石無魚;;病毒是我們的“助產(chǎn)婆”[J];大科技(科學之謎);2011年04期

9 紀昕,翁梁,曹淑桂,馮雁;非病毒基因治療的研究進展[J];生物學雜志;2002年02期

10 劉銘;;病毒幫助人類進化[J];環(huán)境;2002年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁鏟;;病毒的進化與傳播[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會第二次學術(shù)研討會論文集[C];2010年

2 紀昕;翁梁;曹淑桂;馮雁;;非病毒基因治療的研究進展[A];“加入WTO和科學技術(shù)與吉林經(jīng)濟發(fā)展——機遇·挑戰(zhàn)·責任”吉林省第二屆科學技術(shù)學術(shù)年會論文集（下）[C];2002年

3 陳柳;云濤;余斌;倪征;華炯鋼;李雙茂;;禽病毒免疫逃避的機制[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十五次學術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 李洋;金寧一;韓松;魯會軍;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子生物學研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次學術(shù)研討會論文集[C];2007年

5 吳建國;;病毒與致病、致癌因子的相互作用及功能研究[A];湖北省生物工程學會2004年年會學術(shù)報告及論文摘要匯編[C];2004年

6 黃娟;姜平;張常印;唐泰山;李永東;張治濤;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時PCR檢測方法的建立[A];第六屆全國會員代表大學暨第11次學術(shù)研討會論文集（上）[C];2005年

7 黃娟;姜平;張常印;唐泰山;李永東;張治濤;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時PCR檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學術(shù)研討會論文集[C];2005年

8 張航;劉梁;孟祥高;劉長林;;多苯并咪唑金屬配合物—一類新型非病毒基因釋放的載體[A];第六屆全國化學生物學學術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

9 李俊;王金寶;張禎濤;周順;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)分子生物學研究進展[A];山東畜牧獸醫(yī)學會養(yǎng)豬專業(yè)委員會第一屆學術(shù)研討會論文集[C];2007年

10 萬遂如;;當前我國豬群中新出現(xiàn)的病毒感染[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次人獸共患病學術(shù)研討會暨第六屆第十四次教學專業(yè)委員會論文集[C];2012年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報記者 張夢然;病毒預警 未雨綢繆[N];科技日報;2010年

2 肖園;病毒與人體的較量 是殺死還是共存？[N];北京科技報;2012年

3 胡軒逸;病毒，與生命如影隨形[N];光明日報;2014年

4 張?zhí)锟?病毒可能幫助人類進化[N];健康報;2001年

5 曉 陽;高科技驗血病毒旋即現(xiàn)形[N];大眾科技報;2004年

6 林子;人類與病毒之戰(zhàn)永無寧日？[N];中國商報;2003年

7 奇云;如果沒有病毒 世界會怎樣[N];大眾科技報;2003年

8 本報記者 王丹 譚嘉;病毒跨種傳播研究需要“剝洋蔥”[N];健康報;2013年

9 李文;病毒致癌機制研究最新進展[N];中國醫(yī)藥報;2008年

10 記者 劉海英;病毒會利用微RNA對人體實施攻擊[N];科技日報;2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李麗薇;細胞miRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）復制的相關(guān)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

2 劉長龍;豬繁殖與呼吸綜合征病毒3’非編碼區(qū)對病毒復制調(diào)控作用解析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2010年

3 高飛;豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非編碼區(qū)順式作用元件的解析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

4 譚菲菲;豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白在病毒復制過程中的作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2010年

5 賀云霞;應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2006年

6 陸嘉琦;豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非翻譯區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能解析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2011年

7 張福明;網(wǎng)狀分枝擴增技術(shù)檢測EB病毒基因的方法建立及臨床應(yīng)用研究[D];吉林大學;2004年

8 陳小云;豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJ-4株感染性分子克隆的構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2004年

9 王蕾;單純皰疹病毒Ⅰ型VP26蛋白在病毒感染過程中的分子生物學功能分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2008年

10 黃娟;shRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在Marc145細胞中復制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2006年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 霍鵬;利用多重熒光定量PCR鑒定番木瓜病毒及番木瓜eIF4E家族基因干擾效應(yīng)研究[D];海南大學;2015年

2 白云;豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5a功能的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

3 黃豆豆;2010-2011北京冬春季成人急性腹瀉相關(guān)病毒及新發(fā)病原體分子流行病學研究[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

4 夏燕平;EV71感染相關(guān)miRNA篩選及FNC抗EV71活性研究[D];河南中醫(yī)學院;2015年

5 朱攀;昆明市小兒腹瀉相關(guān)病毒的分子流行病學研究及病毒基因組克隆[D];昆明理工大學;2013年

6 陳弘;上海、山西地區(qū)HIV-1分離株vif基因序列分析[D];復旦大學;2009年

7 顏丕熙;鴨坦布蘇病毒分離鑒定及其生物學特性的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

8 韓繼剛;小球藻病毒的分離提純及其幾丁質(zhì)酶基因的克隆[D];河北大學;2000年

9 姜曉林;“發(fā)熱伴血小板減少綜合征”病毒傳播媒介及宿主調(diào)查研究[D];山東大學;2012年

10 朱佳毅;豬繁殖與呼吸綜合征病毒四種檢測方法的比較[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2012年

，

本文編號：877199